Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Resumo

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Resumo

O estudo da eritropoiese visa compreender como as células vermelhas são formadas a partir progenitores antes hematopoiéticas e eritróide. Especificamente, a taxa de formação de células vermelhas é regulada pelo hormônio eritropoietina (EPO), cuja síntese é desencadeada pela hipóxia tecidual. Uma ameaça aos resultados tecido adequado de oxigenação em um rápido aumento da EPO, conduzindo a um aumento na taxa de eritropoiética, um processo conhecido como a resposta ao estresse eritropoiética. O aumento resultante do número de eritrócitos melhora a entrega de oxigênio nos tecidos. Uma resposta ao estresse eficiente eritropoiética é, portanto, fundamental para a sobrevivência e recuperação de condições fisiológicas e patológicas, tais como altitude elevada, anemia, hemorragia, quimioterapia ou transplante de células-tronco.

O rato é um modelo fundamental para o estudo da eritropoiese e sua resposta ao estresse. Eritropoiese rato definitiva (do tipo adulto) ocorre no fígado fetal entre os dias embrionárias 12,5 e 15,5, no baço neonatal e adulto no baço e medula óssea. Métodos clássicos de identificação de progenitores eritróides no tecido dependem da capacidade dessas células de dar origem a colônias de células vermelhas quando banhado em Epo contendo semi-sólido mídia. Sua progênie precursor eritróide são identificados com base em critérios morfológicos. Nenhum destes métodos clássicos permitir o acesso a um grande número de células em estágio de diferenciação eritróide específicos para o estudo molecular. Aqui apresentamos um método de fluxo de citometria de identificar e estudar a diferenciação progenitores estágio-específicas e de precursores eritróides, diretamente no contexto do tecido do rato recém-isoladas. O ensaio conta com os marcadores de superfície celular CD71, Ter119, e no parâmetro de fluxo de citometria de "dispersão para a frente ', que é uma função do tamanho da célula. O ensaio CD71/Ter119 pode ser usado para estudar progenitores eritróides durante a sua resposta ao estresse eritropoiética in vivo, por exemplo, em ratos ou camundongos anêmicos alojados em condições de baixo oxigênio. Também pode ser usado para estudar progenitores eritróides diretamente nos tecidos de ratos adultos geneticamente modificados ou embriões, a fim de avaliar o papel específico da via molecular modificado na eritropoiese.

Protocolo

1. Colheita de tecidos

1. Prepare tubos contendo 2-5 ml de tampão de coloração a frio (tampão fosfato (PBS), com adição de BSA 0,2% e glicose 5mM). Manter tubos em gelo antes da colheita de tecidos.
2. Camundongos abate de acordo com o protocolo aprovado apropriado (por exemplo, inalação de CO ₂ seguido por deslocamento cervical).
3. Coleta de sangue por punção cardíaca em EDTA ou heparina de coleta de sangue, tubos para posterior análise, por exemplo, do hematócrito, contagem de reticulócitos ou análise CBC.
4. Colheita do baço e ossos, colocando tecidos de cada rato em um tubo separado, preparado na etapa 1. Fácil acesso ao baço é do lado esquerdo. Para a colheita de medula óssea, um ou ambos os fêmures. Mantenha tecidos colhidos no gelo.
5. Se desejar, pesar o baço. Ratos submetidos a uma resposta ao estresse eritropoiética é provável que mostram um aumento significativo no peso do baço.

2. Preparação de células do baço

1. Usando um pré-umedecidos 3 ml êmbolo da seringa, empurre o baço, ou de parte do baço (idealmente, 0,1 gramas ou menos, o equivalente a cerca de 10 ⁸ células) através de um filtro de células 40 mM estéril (Fisherbrand número de catálogo 22363547 ou outros) colocado no topo de um tubo de 50 ml. Manter o tubo em gelo durante este procedimento. Lave as células através do filtro com um total de 2 ml de buffer coloração.
2. Pipeta suavemente a suspensão de células tensas para quebrar qualquer pequenos aglomerados. Se necessário, re-tensão das células.
3. Lave as células duas vezes por centrifugação e re-suspensão em tampão frio.
4. Contar as células usando um hemocitômetro. Rendimentos típicos são 1-2 x 10 ⁸ células / baço. Citometria de fluxo para análise, aliquote 1-2000000 células por amostra, tanto em tubos de coloração FACS (BD Falcon de poliestireno de fundo redondo de tubos, 352008) ou U bottom-placa de 96 poços (BD Falcon 353.910). Volume de coloração da amostra é de 200 mL, a uma concentração celular final 0,5-1 x 10 ⁷ células / ml ou 1-2 x 10 ⁶ células / mL de amostra 200.

3. Preparação de células da medula óssea

1. Prepare 1 ou 3 ml seringas com agulha acoplada 26G, pré-cheia com tampão de coloração a frio.
2. Remover músculos ligados ao fêmur, de modo a visualizar o osso de forma clara.
3. Usando afiada tesoura cirúrgica, cortando ambas as extremidades do fêmur, o mais próximo possível às extremidades do osso. Isso deve revelar um pequeno furo em cada extremidade de corte, levando para dentro da cavidade da medula óssea, que atravessa o comprimento do fêmur.
4. Usando as seringas pré-carregadas no passo 1, inserir a agulha através de um desses buracos, e gentilmente liberar a medula para fora através do furo no outro extremo, em um tubo.
5. Dissociar as células liberadas por pipetagem gentil, e tensão através de um filtro 40 mM como para o baço acima (ver secção 2.1).
6. Lave as células duas vezes por centrifugação em tampão coloração a frio
7. Contar as células e ressuspenda como no ponto 2.4. Rendimentos típicos são cerca de 10 ⁷ células por fêmur.

4. Preparação de células do fígado fetal

1. Para preparar timed-fêmeas grávidas de ratinhos, ratos criados para o acasalamento, à noite; examinar para plugues vaginal antes das 10 horas do dia seguinte, o dia em que o plugue vaginal é detectado é considerado o dia 0,5. Pessoal veterinário pode ser capaz de ajudar os investigadores que não estão familiarizados com esta técnica para identificar as fêmeas grávidas. A gravidez também pode ser determinada pelo peso do mouse de monitoramento.
2. Cronometrado grávidas camundongos fêmeas são abatidas em dias 12,5-14,5 da gravidez. Os cornos uterinos foram removidos em um prato de Petri contendo gelada meio de cultura ou buffer de coloração.
3. Embriões são retirados de cada útero e no fígado fetal é dissecado. Um microscópio de dissecação é necessário para dia embrionário 12,5 (E12.5) ou menos.
4. Fígados podem ser dissociados mecanicamente por pipetagem no buffer, e são processados ​​individualmente em 96 placas de bem, ou agrupados, dependendo dos requisitos experimental.
5. Um fígado fetal em E13.5 tem ~ 10 ⁷ células. As células são lavadas duas vezes em coloração de buffer e ressuspendido em 1-2 x 10 ⁶ células / mL de amostra 200 para análise de citometria de fluxo.

5. Coloração de anticorpos por citometria de fluxo

1. Preparar um anticorpo primário coloração pré-mistura para ser usado para todas as amostras, exceto para as amostras de controle, contendo o seguinte:
   • ChromePure coelho IgG (Jackson, 015-000-003), para uma concentração final de 200μg/ml. Verificar a concentração de ações na garrafa (pode variar). Isto é usado para bloquear os receptores Fc das células mouse; espécies alternativas que podem ser usados ​​para isso são do rato ou o rato IgG IgG. Escolha das espécies é determinada pela presença potencial no protocolo de coloração de anticorpos dirigidos contra ratos secundário primário / mouse / rabbit anticorpos, caso em que essas espécies não pode ser usadod como anticorpos de bloqueio. Alternativamente, soro de coelho 5% também pode ser usado no lugar de IgG purificada. Uma outra alternativa é o uso de anticorpos monoclonais ou fragmentos Fab dirigido aos receptores Fc do mouse. O protocolo básico abaixo não incluem quaisquer anticorpos secundários e assim por IgG de qualquer das três espécies podem ser utilizadas.
   • CD71-FITC, diluído 1:200 (estoque 0,5 mg, BD-Biosciences, 553266)
   • Ter119-PE, diluído 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673)
   • Quaisquer anticorpos adicionais dirigidos para epítopos da superfície de interesse, por exemplo, anticorpos dirigidos a Fas ou FasL (veja ^1,2). Misturar a solução de anticorpo suavemente invertendo o tubo 2-3 vezes.
2. Adicionar 200 mL da mistura pré-para cada amostra de células e gentilmente re-suspender as células.
3. Prepare amostras de células controle da seguinte maneira:
   • "Corado": essas células são deixados no buffer de coloração e fornecer a autofluorescência de fundo das células.
   • 'Cor Único "controles: um tal controle é necessário para cada anticorpo / cor usados ​​no protocolo. As células nesses controles estão manchadas ou com um anticorpo conjugado diretamente primária, ou com ambos os anticorpos primário e um anticorpo conjugado secundário. Estes controles são usados ​​para corrigir a sobreposição espectral entre os canais.
   • "Fluorescência menos um" (FMO) controles: um tal controle é necessário para cada anticorpo / cor no protocolo: as células são coradas com todas as cores / anticorpos no protocolo, exceto para a cor / anticorpo para o qual este é o controle FMO. O controle FMO para um canal específico fornece a base verdadeira para aquele canal. Pode incluir não específica de anticorpos do isotipo mesmo, e conjugado com a mesma marca de fluorescência como o teste de anticorpo (controle isotipo).
4. Incubar as amostras e controles relevantes no anticorpo primário mancha no gelo por 45 'para uma hora no escuro (colocar cobertura de alumínio de alumínio em balde de gelo).
5. No final da incubação, lavar as células adicionando 3 ml de tampão de coloração para cada tubo de amostra e girar para 3 'para 5' em aproximadamente 400 xg, a 4 ° C. Se usar 96 placas bem, lave as células três vezes em um volume de 200 mL.
6. Caso, aplicar anticorpo secundário mancha. Aplicar e lavar como para o primeiro anticorpo mancha.
7. Se necessário, uma mancha com anexina V é aplicada no final da incubação, usando um tampão Hepes como nas instruções do fabricante. Esta mancha é aplicada por 15 minutos em temperatura ambiente, ou por 1 hora no gelo.
8. Células são re-suspenso por citometria de fluxo análise na coloração solução contendo um corante de DNA de células-impermeável, para excluir as células mortas. Corantes DNA estão disponíveis várias, incluindo iodeto de propídio, 7-amino-actinomicina D (7AAD), ou DAPI. A escolha entre estas depende dos canais disponíveis, dada a canais de retomada para a coloração de anticorpos específicos, e os canais disponíveis no citômetro de fluxo. 7AAD é obtido a partir BD-Biosciences (559.925) e usado de acordo com as instruções do fabricante. Para a coloração DAPI, faça um estoque de 1mg/ml em dimetilformamida (DMF) de pó (Roche, Cat # 236276), manter a -20 ° C, e diluir 1:10.000 a 1:15.000 na coloração buffer.

6. Citometria de fluxo de classificação

1. Células são marcadas com anticorpos contra CD71, Ter119, marcadores de linhagem, e um corante de viabilidade, conforme descrito para o fluxo de citometria-análise (seção 5). Concentração celular durante a rotulagem pode ser aumentada para 5 x 10 ⁷ / ml.
2. Misturar um volume igual de cada um dos seguintes anticorpos para fazer o mix mestre da linhagem:
   • FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD PharMingen 553848
   • FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD PharMingen 553087
   • FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD PharMingen 553061
   • Rat FITC Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD PharMingen 557396
   • Rat FITC anti-rato Ly 6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD PharMingen 553126
   • Use a mistura mestre em 1:80 (Isto é equivalente a 1:400 diluição de cada anticorpo ações individuais, que são todos de 0,5 mg / ml).
3. Use condições de baixa pressão de classificação e bicos de largura. Para a Aria (BD Biosciences) usamos 100 bico μ, 20 psi de pressão.
4. Coleta de buffer: PBS, com adição de 20% de soro fetal bovino.
5. Para verificar a pureza das populações classificadas, re-executar uma pequena alíquota de cada amostra em um buffer que contém um corante de viabilidade (7AAD ou similar).

7. Resultados representativos:

CD71/Ter119 coloração de adulto da medula óssea ou baço identifica uma seqüência de desenvolvimento de quatro subconjuntos, ProE rotulados, Erya, EryB e Eryc (Figura ¹⁾ 1. Morfologicamente, estas correspondem a eritroblastos cada vez mais maduro. A figura 1 ilustra a seqüência de propagação na fase de análise de dados, que descarta evento muito pequeno (incluindo núcleos, glóbulos vermelhos), as células agregadas e células mortas.

Expressão de proteínas da superfície celular podem ser medidos simultaneamente para cada um desses subconjuntos, somando os anticorpos relevantes, ao mesmo tempo como Ter119 CD71 e coloração. A Figura 1 mostra um exemplo de superfície celular expressão do receptor de morte Fas ^1. Esta medida foi realizada em camundongos injetados com Epo, ou em ratos injetados com solução salina. É evidente que a epo suprime a expressão de Fas na população Erya in vivo ^1.

Expressão de proteínas intracelulares ou status do ciclo celular também podem ser medidos para as células em cada subconjunto. A figura 2 ilustra a análise do ciclo celular representante de células da medula óssea recém-colhido. Estas medidas requerem, além da coloração da superfície celular com CD71 e Ter119, a fixação e permeabilização das células para a rotulagem intracelular (ver secção Discussão).

No fígado fetal, não-eritróide células são excluídos, pela passagem do 'Lin' células que são negativos para CD41, Mac-1, Gr-1, B220 e CD3 (Figura 3). As células restantes são sub-divididos em 6 subgrupos, S0 a S5. As características precisas de células no fígado fetal é dependente da idade embrionária (ver secção Discussão). A análise do ciclo celular representante do subconjunto S3 em E13.5 fígado fetal é mostrada (Figura 4).

Figura 1 O CD71/Ter119 subconjuntos eritróide no baço do rato A. estratégia Gating:.. Células do baço foram processados ​​e rotulados com anticorpos dirigidos a CD71, Ter119 e Fas. Esta figura mostra a estratégia de análise após a etapa de aquisição de dados. Histograma I mostra todos os eventos adquiridos. O portão diagonal representa eventos que são susceptíveis de ser uma única célula, excluindo doublets ou agregados maiores. Células nesta portão são ainda analisados ​​II histograma. Eventos aqui muito pequeno, provavelmente núcleos ou detritos, são excluídos. As células gated são mostrados na III histograma, onde DAPI-positivos células, que são susceptíveis de membrana-permeável células apoptóticas, são excluídos da análise posterior. IV histograma mostra a população resultante de células do baço viável. O portão ProE contém CD71 ^alta Ter119 células ^{intermediárias.} Ter119 células ^{de alta} são ainda analisados ​​em histograma V. Aqui células CD71 ^alta são subdivididas em menos maduros, grandes 'Erya' eritroblastos (CD71 ^alta Ter119 ^alta FSC ^alto) e menores, mais madura "EryB 'eritroblastos (CD71 ^alta Ter119 ^alta FSC ^baixa) . O subconjunto de eritroblastos mais maduros é Eryc (CD71 ^baixo Ter119 ^alta FSC ^baixo). VI histograma mostra da superfície da célula expressão de Fas, especificamente no subconjunto Erya, em camundongos, no estado basal (injetados com salina), e os camundongos injetados com uma única dose de EPO. Coloração com anticorpos Fas foi realizada simultaneamente com a coloração CD71/Ter119. Preparações de células B. Cytospin classificados de cada um dos subconjuntos indicado. As células foram coradas com Giemsa e com diaminobenzidina, este último gera uma mancha marrom com a hemoglobina. Dados Cytospin foi publicado originalmente em Liu et al. Blood. 2006 01 de julho; 108 (1) :123-33. Epub 2006 9 de março.

Figura 2. Análise do ciclo celular do CD71 ^alta Ter119 ^alta eritroblastos na medula óssea do rato. Camundongos foram injetados intraperitonealmente com BrdU, e do baço ou da medula óssea foram colhidas 30 a 60 minutos mais tarde. As células foram fixadas e permeabilizadas e além de ser manchada para CD71 e Ter119, foram coradas para incorporação BrdU em seu DNA a replicar com um anticorpo monoclonal dirigido a BrdU (protocolo permeabilização fixação e coloração BrdU foi de acordo com as instruções do fabricante). BrdU células positivas estão em fase S do ciclo. Células em interfase são BrdU-negativo e pode ser resolvido em fases G1 ou G2 / M, usando o DNA de corante 7AAD.

Figura 3 CD71/Ter119 subconjuntos eritróide no fígado do rato fetal A. estratégia Gating:.. Células do fígado fetal foram etiquetados para CD71, Ter119, e um coquetel de FITC-rotulados anticorpos dirigidos a marcadores de linhagem não-eritróide ('Lin'). Células viáveis ​​(7AAD-negativos) foram analisadas para expressão Lin, eo Lin-células são subdivididas em a S0 a S5 subconjuntos eritróide. Mais jovens, E13 fígado fetal é composto de eritroblastos menos maduros, mostrado pela ausência de células maduras na S4/S5 subconjuntos. Preparações de células B. Cytospin classificados de cada um dos subconjuntos indicado. As células foram coradas com Giemsa e com diaminobenzidina, este último gera uma mancha marrom com a hemoglobina. Dados Cytospin foi originalmente published em Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484.

Figura 4. Análise do ciclo celular de subconjuntos fígado fetal eritróide. Fêmeas grávidas foram injetados com BrdU, e fígados fetais foram colhidas 30 a 60 minutos mais tarde, fixa, permeabilizadas e coradas com anticorpos contra CD71, Ter119 e BrdU. Estado do ciclo celular de células S3 é mostrado.

Discussão

A metodologia de citometria de fluxo permite investigação simultânea de qualquer função celular que pode ser detectado com um anticorpo conjugado com fluorescência específica ou ligante, incluindo marcadores da superfície celular, a expressão da proteína, a sobrevivência celular, sinalização celular usando fosfo anticorpos específicos ³ e status de ciclo celular. Estas medições podem ser feitas em cada um de uma série de estágios de diferenciação subconjuntos específicos, no contexto da r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Fas-biotina	BD PharMingen	554256
Estreptavidina-APC	Sondas moleculares	S868
40 mM filtro célula estéril	Fisherbrand	22363547
Poliestireno de fundo redondo de tubos para a coloração FACS	BD Falcon	352008
U bottom-placa de 96 poços	BD Falcon	353910
ChromePure coelho IgG	ImmunoResearch Jackson	015-000-003
CD71-FITC (estoque 0,5 mg)	BD-Biosciences	553266
Ter119-PE (stock 0.2mg/ml)	BD-Biosciences	553673
7AAD	BD-Biosciences	559925
DAPI em pó	Roche	236276
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30	BD PharMingen	553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2	BD PharMingen	553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70	BD PharMingen	557396
Rat FITC anti-rato Ly 6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD PharMingen	553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11	BD PharMingen	553061
APC BrdU Fluxo de kit	BD PharMingen	557892
Anexina V-biotina	BD PharMingen	556418