Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

Резюме

Блок-цитометрии метод для идентификации и молекулярного анализа дифференциации стадии конкретных мышиной предшественников эритроидных и прекурсоров, прямо в только что заготовленных мозга мыши костей, селезенки и печени плода. Анализ основывается на поверхности клеток маркеры CD71, Ter119 и размера ячейки.

Аннотация

Исследования эритропоэза цели понять, как красный клетки образуются из более ранних гемопоэтических и эритроидных предшественников. В частности, скорость образования красных клетка регулирует гормон эритропоэтин (ЭПО), синтез которых вызывается тканевой гипоксии. Угроза на достаточное оксигенации тканей приводит к быстрому увеличению ЭПО, что привело к увеличению эритропоэза случае, процесс, известный как эритропоэтин реакцию на стресс. В результате увеличение количества циркулирующих эритроцитов улучшает доставку кислорода в тканях. Эффективное эритропоэтической стрессовой реакции является поэтому чрезвычайно важным для выживания и восстановления от физиологических и патологических состояний, таких как большой высоте, анемия, кровотечение, химиотерапии или трансплантации стволовых клеток.

Мышь ключевых модель для исследования эритропоэза и его стрессовую реакцию. Мышь окончательного (взрослый тип) эритропоэза происходит в печени плода между эмбриональными дней 12,5 и 15,5, в неонатальном селезенки и во взрослой селезенке и костном мозге. Классические методы определения эритроидных предшественников в ткани полагаются на способность этих клеток вызвать красные колонии клетка при посеве в Epo содержащих полутвердых СМИ. Их эритроидных предшественников потомства опознаются по морфологическим критериям. Ни один из этих классических методов обеспечения доступа к большому числу дифференциации стадии конкретных эритроидных клеток для молекулярных исследований. Здесь мы представляем потока цитометрии метод идентификации и изучения дифференциации стадии конкретных эритроидных предшественников и прекурсоров, непосредственно в контексте свежевыделенных мыши ткани. Анализ основывается на поверхности клеток маркеры CD71, Ter119, а на поток-цитометрии параметр "вперед рассеяния", которая является функцией от размера ячейки. CD71/Ter119 анализ может быть использован для изучения эритроидных предшественников во время их реакции на стресс эритропоэтической в ​​естественных условиях, например, у анемичных мышей или мышей размещалась в условиях низкой кислорода. Он также может быть использован для изучения эритроидных предшественников непосредственно в тканях генетически модифицированных взрослых мышей или эмбрионов, с тем чтобы оценить специфическую роль изменение молекулярный путь в эритропоэза.

протокол

1. Заготовка тканей

1. Подготовка пробирки, содержащие от 2 до 5 мл холодного буфера окрашивания (фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,2% БСА и 5 мМ глюкозы). Хранить трубы на льду до ткани урожая.
2. Калл мыши по соответствующим утвержденным протоколом (например, CO ₂ ингаляции следуют шейный дислокации).
3. Нарисуйте крови пункции сердца в ЭДТА или гепарин крови сбора труб для последующего анализа, например, гематокрита, ретикулоцитов или CBC анализа.
4. Урожай селезенки и костей, размещение ткани от каждой мыши в отдельной трубе, подготовленной на шаге 1. Легкий доступ к селезенки с левой стороны. Для костного мозга, урожай одного или обоих бедер. Держите собрано ткани на льду.
5. При желании, весят селезенки. Мыши проходят эритропоэтической стрессовая реакция, скорее всего, указывают на значительное увеличение веса селезенки.

2. Подготовка клетки селезенки

1. Использование предварительно смоченным 3 мл шприца, слегка надавите селезенка, или часть селезенки (в идеале, 0,1 грамма или меньше, что эквивалентно приблизительно 10 ⁸ клеток) через 40 мкм стерильный фильтр клетки (Fisherbrand каталожный номер 22363547 или другой) размещены в верхней части 50 мл коническую трубку. Держите пробирку на льду во время этой процедуры. Вымойте клеток через сито с в общей сложности 2 буфера окрашивания мл.
2. Аккуратно пипетки напряженными суспензии клеток, чтобы разбить любые небольшие пряди. При необходимости заново деформации клетки.
3. Вымойте клетки в два раза путем центрифугирования и повторно приостанавливать в холодной буфера.
4. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Типичные выходы 1-2 х 10 ⁸ клеток / селезенки. Для потока цитометрии анализа, aliquote 1 до 2 миллионов клеток в образце, либо в пробирки, FACS окрашивания (BD Сокол полистирола с круглым дном трубы, 352008) или U-дно 96 ячейках (BD Сокол 353 910). Объем Пример окрашивания составляет 200 мкл, чтобы конечная концентрация ячейки от 0,5 до 1 х 10 ⁷ клеток / мл или 1-2 х 10 ⁶ клеток / 200 мкл образца.

3. Подготовка клетки костного мозга

1. Подготовка 1 или 3 мл шприцы с прикрепленным 26G иглу, предварительно заполнены холодной буфера окрашивания.
2. Удалить мышцы крепятся к бедренной таким образом, чтобы визуализировать кости ясно.
3. Использование резкого хирургические ножницы, отрежьте оба конца бедренной кости, как можно ближе к концам костей. Это должно выявить небольшое отверстие в каждый срез, ведущий в полость костного мозга, которая проходит через длины бедренной кости.
4. Использование предварительно заполненных шприцев в шаге 1, вставить иглу через одну из этих дыр, и осторожно промыть мозг через отверстие на другом конце, в трубке.
5. Диссоциируют промыть клетки, осторожно пипеткой, и процедить через сито 40 мкм как для селезенки выше (см. раздел 2.1).
6. Вымойте клетки в два раза путем центрифугирования в холодной буфера окрашивание
7. Граф клетки и ресуспендируют как в разделе 2.4. Типичные дает примерно 10 ⁷ клеток на бедра.

4. Подготовка фетальных клеток печени

1. Для подготовки тайм-беременных самок мышей, созданная для спаривания мышей в вечернее время, изучить для вагинальной пробки до 10 часов утра следующего дня; день, вагинальные вилка обнаружены считается день 0.5. Ветеринарный персонал может быть в состоянии помочь следователям, кто не знаком с этой техникой для выявления беременных женщин. Беременность может быть определена путем контроля веса мыши.
2. Временный беременных самок мышей отобраны в дни 12,5 до 14,5 беременности. Рогах матки удаляются в Петри-блюдо с ледяной культуральной среде или окрашивание буфера.
3. Эмбрионы будут удалены друг от матки и плода печень расчленены. Рассекает микроскоп, необходимых для эмбрионального день 12,5 (E12.5) или моложе.
4. Печень могут быть отделены механически с помощью пипетки в буфер и обрабатываются либо индивидуально, в 96-луночных или объединены вместе, в зависимости от экспериментальных требованиям.
5. Фетальной печени на E13.5 имеет ~ 10 ⁷ клеток. Клетки дважды промывали в буфере и окрашивание ресуспендируют в 1-2 х 10 ⁶ клеток / мкл 200 проб для проточной цитометрии.

5. Антитела окрашивания для проточной цитометрии

1. Подготовка первичных антител окрашивания предварительного смешивания, который будет использоваться для всех образцов, за исключением контрольных образцов, содержащих следующее:
   • ChromePure кролика IgG (Джексон, 015-000-003), чтобы конечная концентрация 200μg/ml. Проверьте концентрацию на фондовом бутылку (она может варьироваться). Это используется, чтобы блокировать Fc рецепторы в мышиных клетках; альтернативных видов, которые могут быть использованы для этого с помощью мыши или крысы IgG IgG. Виды выбор определяется потенциал присутствия в окрашивании протокол вторичных антител, направленных против первичного крыса / мышь / кролик антител, и в этом случае те виды, не могут быть использованыг как блокирующие антитела. Кроме того, 5% сыворотки кролика может также быть использован вместо очищенных IgG. Дальнейшее альтернативой является использование моноклональных антител или Fab фрагменты направлены на мышь рецепторы Fc. Основной протокол ниже не включает в себя вторичные антитела IgG и так любой из трех видов могут быть использованы.
   • CD71-FITC, разбавленной 1:200 (фондовый 0.5mg/ml, BD-биологических наук, 553266)
   • Ter119-PE, разбавленной 1:200 (фондовый 0.2mg/ml, BD-биологических наук, 553673)
   • Любые дополнительные антитела, направленные на поверхности эпитопами интереса, например, антитела, направленные на Fas или FasL (см. ^1,2). Смешайте раствор антител мягко путем обращения трубки 2-3 раза.
2. Добавить 200 мкл с предварительным смешиванием в каждую ячейку образца и мягко повторно приостанавливать клеток.
3. Подготовка контрольных образцов ячейки следующим образом:
   • «Необработанный ': эти клетки остаются в буфере окрашивания и обеспечить фоне флуоресценции клеток.
   • "Единое цвет" элемента управления: один такой контроль необходим для каждого антитела / цвет, используемый в протоколе. Клеток в этих элементах управления окрашиваются либо непосредственно сопряженных первичных антител, или как с первичного антитела и сопряженных вторичными антителами. Эти элементы управления используются для коррекции спектральных перекрытия между каналами.
   • "Флуоресценция минус один" (FMO) элемента управления: один такой контроль необходим для каждого антитела / цвет в протокол: клетки окрашиваются всеми цветами / антител в протоколе, за исключением цвета / антитела, для которых это управление FMO. Контроль FMO для конкретного канала обеспечивает истинный фон для этого канала. Она может включать неспецифические антитела одного и того же изотипа, и сопряженных с теми же флуоресценции пометить как тест на наличие антител (изотипа контроля).
4. Инкубируйте образцы и соответствующие управления в первичных антител пятно на льду в течение 45 мин до 1 часа в темноте (положить крышку из алюминиевой фольги на льду-ковш).
5. В конце инкубации, мыть клетки, добавляя 3 мл окрашивания буфера в каждую пробирку образца и спина в течение 3 к 5 "в примерно 400 мкг при 4 ° C. При использовании 96-луночных, мыть клетки три раза в объеме 200 мкл.
6. Если уместно, применять вторичные антитела пятно. Применить и мыть, как и для первого антитела пятно.
7. Если уместно, пятно Аннексин V применяется в конце инкубации, с использованием буфера HEPES, как в инструкции производителя. Это пятно наносится в течение 15 минут при комнатной температуре или в течение 1 часа на льду.
8. Клетки ресуспендировали для потока цитометрии анализа окрашивание раствора, содержащего клеточной ДНК непроницаемой краситель, чтобы исключить мертвые клетки. Несколько красителей ДНК доступны, в том числе пропидия йодидом, 7-амино-актиномицина D (7AAD), или DAPI. Выбор из числа этих зависит от доступных каналов, учитывая каналы взяты для специфического окрашивания антител и каналов, доступных на поток-цитометр. 7AAD получается из BD-биологических наук (559925) и используются в соответствии с инструкциями производителя. Для окрашивания DAPI, сделать запас 1mg/ml в диметилформамиде (DMF) из порошка (Roche, Cat # 236276), держите при температуре -20 ° С, и развести 1:10000 до 1:15,000 в окрашивании буфера.

6. Flow-цитометрии сортировки

1. Клетки, меченных антител против CD71, Ter119, родословная маркеры и жизнеспособность красителя, как описано для потока цитометрии анализа (раздел 5). Сотовые концентрации во время маркировки может быть увеличен до 5 × 10 ⁷ / мл.
2. Смешайте равные объемы каждой из следующих антител, чтобы сделать смесь линии мастер:
   • FITC Крыса Анти-CD41 мыши MWReg30, BD Pharmingen 553848
   • FITC Крыса антимышиным CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087
   • FITC Hamster антимышиным CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061
   • FITC Крыса антимышиным CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396
   • FITC Крыса антимышиным Ly-6G и Ли-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126
   • Используйте мастер смеси на 1:80 (Это эквивалентно 1:400 разбавления каждого отдельного запасов антитела, которые все 0,5 мг / мл).
3. Использование низкого давления сортировки условия и широкий сопла. Для Ария (BD Biosciences) мы используем 100 μ сопла, 20 фунтов на квадратный дюйм давления.
4. Коллекция буфера: PBS с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки.
5. Для проверки чистоты из отсортированных населения, повторные небольшие аликвоту из каждого образца в буфер, который содержит жизнеспособность красителя (7AAD или аналогичный).

7. Представитель Результаты:

CD71/Ter119 окрашивание взрослого костного мозга или селезенки определяет развитие последовательность из четырех подмножеств, помечены ProE, EryA, EryB и EryC (рис. ¹⁾ 1. Морфологически они соответствуют более зрелым эритробластов. На рисунке 1 показано стробирования последовательности на этапе анализа данных, которая отбрасывает очень небольшое мероприятие (в том числе ядер, эритроцитов), агрегированных клеток и мертвых клеток.

Экспрессия на поверхности клеток белки могут быть измерены одновременно для каждого из этих подмножеств, путем добавления соответствующих антител, в то же время, как Ter119 и CD71 окрашивания. На рисунке 1 показан пример поверхности клеток экспрессия рецептора смерти Fas ^1. Это измерение было проведено на мышах вводят ЭПО, или в контрольных мышей вводили физиологический раствор. Очевидно, что ЭПО подавляет Fas выражение в популяции в естественных условиях EryA ^1.

Выражение внутриклеточных белков или статуса клеточного цикла также может быть измерен для ячеек в каждом подмножестве. На рисунке 2 показано представитель анализ клеточного цикла из свежесобранных клеток костного мозга. Эти измерения требуют, в дополнение к поверхности клетки окрашивания CD71 и Ter119, фиксации и пермеабилизации клеток для внутриклеточных маркировки (см. обсуждение раздела).

В печени плода, не эритроидных клетках первой исключается литниковой на "Лин-" клетки, которые являются негативными для CD41, Mac-1, Gr-1, B220 и CD3 (рис. 3). Оставшиеся клетки подразделяются на 6 подмножеств, S0-S5. Точная структура клеток в печени плода зависит от эмбрионального возраста (см. обсуждение раздела). Представитель анализ клеточного цикла подмножества S3 в E13.5 фетальной печени показано (рис. 4).

Рисунок 1 CD71/Ter119 эритроидных подмножеств в селезенке мыши А. Память стратегии:.. Клетки селезенки были обработаны и маркированы антител, направленных на CD71, Ter119 и ФАС. Эта цифра показывает анализ стратегии следующим шагом сбора данных. Гистограмма показывает все я приобрел событий. Диагональ ворот представляет события, которые могут быть одиночными клетками, за исключением дублетов или более крупные агрегаты. Ячейки в этих ворот дополнительно проанализированы в гистограмме II. Здесь очень маленьких событий, вероятно, ядер или мусор, исключены. Закрытого клетки показаны на гистограмме III, где DAPI-положительных клеток, которые, вероятно мембраны проницаемыми апоптоза клеток, исключаются из дальнейшего анализа. Гистограмма показывает IV результате население жизнеспособных клеток селезенки. Ворота ProE содержит CD71 ^{высокой} Ter119 ^{промежуточных} клеток. Ter119 ^{высокие} клетки дальнейшему анализу гистограммы в V. При этом клетки CD71 ^{высокой} подразделяются на менее зрелых, большие эритробластов 'EryA' (CD71 ^{высокой} Ter119 ^{высокой} FSC ^{высокий)} и меньшие, более зрелый эритробластов 'EryB' (CD71 ^{высокой} Ter119 ^{высокой} FSC ^{низкий)} . Наиболее зрелые эритробластов подмножество EryC (CD71 ^низкой Ter119 ^{высокой} FSC ^{низкий).} Гистограмма показывает, В. И. клеточной поверхности Fas выражение, в частности, в подмножество EryA, у мышей в базальных состоянии (вводили физиологический раствор) и мышей вводили разовую дозу ЭПО. Окрашивание Fas антитела была проведена одновременно с CD71/Ter119 окрашивания. Б. цитоспина препаратов клетки сортируются от каждого из указанных подмножеств. Клетки окрашивали Гимза и с диаминобензидина, последний генерирует коричневые пятна с гемоглобином. Цитоспина данных была впервые опубликована в Liu и соавт., Крови. 2006 1 июля, 108 (1) :123-33. Epub 2006 9 марта.

Рисунок 2. Клеточного цикла анализа CD71 ^{высокой} Ter119 ^{высокой} эритробластов в костном мозге мышей. Мышам вводили внутрибрюшинно BrdU и селезенки или костного мозга было собрано от 30 до 60 минут спустя. Клетки были фиксированными и проницаемыми, и в дополнение к тому, окрашивают в течение CD71 и Ter119, были окрашены для включения BrdU в их репликации ДНК с моноклональных антител, направленных на BrdU (фиксация, пермеабилизации и BrdU окрашивание протокол в соответствии с инструкцией производителя). BrdU-положительных клеток в S-фазе цикла. Interphase клетки BrdU-отрицательный и может быть решен в G1 или G2 / M фазах, используя ДНК красителя 7AAD.

Рисунок 3 CD71/Ter119 эритроидных подмножества мыши фетальной печени А. Память стратегии:.. Фетальных клеток печени были помечены для CD71, Ter119, а коктейль из FITC-меченных антител, направленных на не-эритроидных линии маркерами («Линь»). Жизнеспособных клеток (7AAD-отрицательные), были проанализированы на выражение Лин и Лин-клетки подразделяются на S0-S5 подмножества эритроидных. Младший, E13 фетальной печени состоит из менее зрелых эритробласты, показали отсутствие клеток в зрелые S4/S5 подмножеств. Б. цитоспина препаратов клетки сортируются от каждого из указанных подмножеств. Клетки окрашивали Гимза и с диаминобензидина, последний генерирует коричневые пятна с гемоглобином. Цитоспина данных изначально рublished в поп и др., PLoS Biol 8 (9):. e1000484. DOI: 10.1371/journal.pbio.1000484.

Рисунок 4. Клеточного цикла анализ фетальной печени подмножества эритроидных. Беременным мышам вводили BrdU, и плода печень собирали от 30 до 60 минут, фиксированная, проницаемыми, и окрашивали антителами против CD71, Ter119 и BrdU. Клеточного цикла статус клеток S3 показано.

Обсуждение

Потока цитометрии методология позволяет одновременно расследовании любых клеточных функций, которые могут быть обнаружены с помощью флуоресценции, конъюгированных специфические антитела или лиганд, в том числе на поверхности клеток маркеры, экспрессии белка, выживаемость клеток, к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Fas-биотин	BD Pharmingen	554256
Стрептавидином АПК	Молекулярные зонды	S868
40 мкм стерильный фильтр ячейки	Fisherbrand	22363547
Полистирол с круглым дном трубы для окрашивания FACS	BD Сокол	352008
U-96 и нижняя пластина	BD Сокол	353910
ChromePure кролика IgG	Джексон ImmunoResearch	015-000-003
CD71-FITC (фондовый 0.5mg/ml)	BD-биологических наук	553266
Ter119-PE (фондовый 0.2mg/ml)	BD-биологических наук	553673
7AAD	BD-биологических наук	559925
DAPI порошок	Roche	236276
FITC Крыса Анти-CD41 мыши MWReg30	BD Pharmingen	553848
FITC Крыса антимышиным CD45R/B220 RA3-6B2	BD Pharmingen	553087
FITC Крыса антимышиным CD411b/Mac-1 M1/70	BD Pharmingen	557396
FITC Крыса антимышиным Ly-6G и Ли-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD Pharmingen	553126
FITC Hamster антимышиным CD3e 145-2C11	BD Pharmingen	553061
APC BrdU потока комплект	BD Pharmingen	557892
Аннексин V-биотин	BD Pharmingen	556418