Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Resumo

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Resumo

A determinação do processo de dobramento de proteínas da sua sequência de aminoácidos para sua estrutura nativa 3D é um problema importante na biologia. Microscopia de força atômica (AFM) pode resolver este problema, permitindo o alongamento e relaxamento das moléculas de proteína único, que dá a evidência direta de desdobramento e dobrar características específicas. AFM-based single-força-espectroscopia molecular (AFM-SMFS) fornece um meio para medir consistentemente alta energia conformações em proteínas que não são possíveis em medições (Bioquímica) em massa tradicional. Embora numerosos foram publicados para mostrar os princípios de AFM-SMFS, não é fácil conduzir experimentos SMFS devido à falta de um protocolo completo exaustivamente. Neste estudo, podemos ilustrar brevemente os princípios da AFM e extensivamente detalham os protocolos, procedimentos e análise de dados como uma diretriz para alcançar bons resultados de experimentos SMFS. Podemos demonstrar resultados representativos de SMFS de medições de desdobramento mecânico só proteína e nós fornecemos a solução de estratégias para alguns comumente encontrado problemas.

Introdução

Avanços em espectroscopia de força única molécula (SMFS) por AFM permitiram a manipulação mecânica e caracterização precisa das moléculas de proteína única. Esta caracterização tem produzido novos insights sobre proteína mecânica^1,2, proteína³de dobramento, de interações proteína-ligante⁴de interações proteína-proteína⁵, e à base de proteínas engenharia materiais de^7,6,8. SMFS é especialmente útil para estudar proteínas desdobramentos, como alongamento por AFM permite que as ligações químicas e físicas dentro da molécula de proteína para estender gradualmente de acordo com a sua rigidez, que dá origem a um comprimento de contorno continuamente crescente. Esta distensão excessiva de uma molécula de proteína pode produzir uma transição abrupta na curva força-extensão, resultando em um evento de ruptura (ou forçar o pico). O pico de força dá informações directas sobre a mudança de força e estrutural desdobramento da proteína durante o processo de desdobramento mecânico. Um dos primeiros estudos usando AFM medido Titina¹ e encontrou novos aspectos da proteína desdobramento e dobrar sob condições fisiológicas, sem o uso de desnaturantes não naturais como produtos químicos concentrados ou temperaturas extremas.

SMFS experimentos são realizados em uma variedade de instrumentos, embora aqui consideramos apenas o AFM. O AFM é composto de quatro elementos principais: a sonda, o detector, o titular da amostra e o scanner piezoelétrico. A sonda é uma ponta afiada na extremidade especulava de um cantilever. Após a calibração, dobra do cantilever durante o alongamento de uma molécula anexada é medido utilizando um feixe de laser que é refletido na parte de trás do cantilever para determinar precisamente as forças usando a lei de Hooke. Os projetos do feixe do laser refletida em um detetor de fotodiodo quadrante que produz uma tensão proporcional ao deslocamento do feixe de laser do centro de diodo. O substrato com a amostra de proteína no líquido é montado sobre um palco piezoelétrico 3D que pode ser controlado com precisão de nanômetros sub. Um computador lê a tensão de detectores fotodiodo e controla o palco 3D através de uma fonte de tensão controlada por computador. Estes estágios de atuador piezo geralmente são equipados com capacitivo ou calibre de tensão-sensores de posição para deslocamento de piezo precisamente medida e histerese correta através do sistema de controle de feedback. A saída de sinal do sensor do controlador piezo é convertida em distância usando a constante tensão do piezo é calibrado de fábrica. Uma curva de força-extensão do exemplo de uma experiência de puxar é mostrada na Figura 2.

Existem dois tipos de experimentos de AFM-SMFS: velocidade constante e a constante força puxando as medições. Medições de força constante SMFS são descritas em Oberhauser et al ⁹, enquanto aqui focamos em medições de velocidade constante. Um experimento típico de puxando de velocidade constante em AFM é feito fornecendo tensão para um piezo para mover suavemente um substrato em relação a dica do cantilever. Um experimento típico tem a ponta inicialmente pressionando contra a superfície. A medição puxa é começada, movendo o substrato longe a ponta de contato. Se uma proteína entra em contato com a ponta inicialmente, ele será puxado e o rastreamento de desdobramento da força contra deslocamento será medido. O substrato é então trazido de volta em contacto com a ponta e um relaxante rastreamento é medido onde enrolamento de proteínas pode ser determinada a partir do deslocamento de força.

Protocolo

1. a proteína preparação

1. Clonagem de DNA.
   1. Sintetizar uma sequência de DNA de interesse, por exemplo, a sequência de DNA de NI₁₀C¹⁰, ou isolar através do PCR do organismo hospedeiro usando padrão biologia molecular técnicas¹¹. Flanqueiam o gene de interesse, com sites de restrição durante a síntese ou colocando sites na extremidade 5'-dos primers PCR para corresponder a um módulo em pEMI91 o plasmídeo (Addgene #74888)¹².
   2. Digeri separadamente tanto o plasmídeo pEMI91¹² e a sequência de DNA de interesse com um par de sítios de restrição para que a sequência de interesse irá ser flanqueada pelo tandem que i91 repete (ver Figura 1). Siga o protocolo padrão para os locais de restrição.
   3. Purificar o produto digerido usando electroforese em gel e depois ligam os produtos usando T4 DNA ligase, seguindo um protocolo padrão. Após a ligadura, transformar o plasmídeo em células de Escherichia coli para purificação de plasmídeo e purificar o plasmídeo usando protocolos padrão. Sequência usando T7 primers ou iniciadores internos pEMI91 para verificar que a sequência foi transformada com êxito.
2. Transformação.
   1. Remover células de expressão de proteínas, tais como C41 (DE3) pLysS células, de um congelador de-80 ° C e descongelar completamente no gelo.
   2. Adicione 1 µ l de Plasmideo DNA para as células e mexa brevemente; pipetagem para cima e para baixo não é aconselhável, pois irá introduzir bolhas de ar e aquecer as células.
   3. Incube o tubo de cultura contendo as células e o plasmídeo no gelo por 30 min.
   4. Calor de choque as células em um banho-maria a 42 ° C por 45 s.
   5. Retorne o tubo de gelo por 2 min.
   6. Coloque 950 µ l de caldo LB nas células e agitar a 250 rpm durante 1 h a 37 ° C.
   7. Coloca cerca de 200 µ l da transformação em placas LB contendo 100 µ g/mL ampicilina. Se usando um plasmídeo diferente de pEMI91, em seguida, use o antibiótico apropriado para esse plasmídeo. Coloque a placa durante a noite em uma incubadora a 37 ° C. No dia seguinte, remover placa da incubadora, enrole com parafilm e armazenamento refrigerado até 1 mês.
3. Expressão da proteína.
   1. Inocule 15 mL do meio de caldo LB com ampicilina 100 de µ g/mL em um tubo de 50ml a 37 ° C para o crescimento da noite tocando uma ponta da pipeta estéril para uma única colônia bacteriana na placa e pipetagem para cima e para baixo em LB.
   2. Transferir a cultura de 15 mL em 1 L de meio de caldo LB com ampicilina 100 de µ g/mL e agitar durante 4-12 h a 37 ° C (até OD₆₀₀ > 0,8).
   3. Colete 10 mL da cultura para a preparação do plasmídeo.
   4. Adicionar 0,2-1 mM isopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e abaixar a temperatura a temperatura ambiente por expressão durante a noite.
   5. Colher células no dia seguinte, dividindo em quatro tubos e centrifugação a 4.000 × g por 40 min e depois congelar a pelota a-80 ° C por várias horas.
   6. Enviar o plasmídeo extraído das células para sequenciamento com os primers correspondente ao estojo inserido da proteína¹² e verificar a fidelidade do ADN inserido.
4. Purificação de proteínas.
   1. Descongele um tubo de células congeladas por 30 min à temperatura ambiente.
   2. Suspender as células descongeladas em tampão de lise (38 mL de água, 2 mL de glicerol, pH de Tris-HCl 50 mM 7.6, 150 mM de NaCl, 1 mM CaCl₂, 10 µ g/mL DNase, 1mm PMSF, 1mm TCEP, 500 lisozima µ g/mL) e agitar no gelo por 1h.
   3. Congelar as células lisadas a-80 ° C por várias horas e então re-descongelar à temperatura ambiente.
   4. Girar o lisado para baixo a 13.100 × g durante 30 min a 4 ° C.
   5. Execute o sobrenadante através de uma coluna de fluxo de gravidade para a tag específica (por exemplo, Strep-marca ou sua marca).
   6. Realize um intercâmbio de buffer usando um filtro centrífugo usando o buffer apropriado para Strep-tag ou sua marca e loja a 4 ° C antes do uso.

2. os slides para preparação de amostra

1. Prepare lâminas de vidro usando solução de Piranha.
   1. Lugar 10-30 peças de rodada lamínulas de vidro (raio de 7,5 mm) em um copo de vidro de 40 mL.
      Nota: Execute este passo e seguir as etapas em um capuz. Siga os procedimentos padrão para lidar com produtos químicos perigosos durante esta etapa.
   2. Adicione 30 mL de ácido sulfúrico de concentrado (18,4 M).
   3. Adicione 10 mL de peróxido de hidrogênio 30%.
   4. Aqueça a mistura por 10-30 min para 95 ° C.
   5. Com cuidado decante a solução Piranha para um contentor de resíduos separado (para ser reutilizado ou descartado).
   6. Enxágue as lâminas com água desionizada para remover a solução de Piranha.
   7. Suspenda os slides em 40 mL de acetona.
   8. Decantar a acetona em um recipiente de resíduos e ressuspender slides em 40 mL de etanol.
   9. Use pinça limpa cuidadosamente extrair um slide de cada vez e seque com argônio ou ar purificado.
   10. Lugar limpos e secadas slides sob vácuo até a evaporação de ouro, ou sob argônio para armazenamento a longo prazo.
2. Prepare slides revestidos ouro (opcionais).
   Nota: Esta etapa exige o uso de um evaporador de vácuo (e-feixe), que está disponível em muitas instalações de sala limpa em grandes universidades.
   1. Corte cinco corrediças do microscópio (forma retangular de 25 x 75 mm) ao meio usando um glasscutter.
   2. Aplicar fita adesiva dupla-face para o meio de cada um dos 10 corrediças do microscópio metade.
   3. Corte o lado pegajoso de uma nota auto-adesiva e aplicar a fita dupla-face para que o lado pegajoso da nota é virada para cima. O lembrete é geralmente menos adesivo, mas ainda firmemente anexa aos slides para evitar quebra de futura. Então as corrediças do microscópio metade agora podem funcionar como suporte de lâminas de vidro.
   4. Pressione cuidadosamente quatro lâminas de vidro limpo (a partir de seção 2.1.10) para cada canto do lado pegajoso do titular.
   5. Mova as lâminas de vidro para um evaporador e-feixe. Seguir as especificações do evaporador para aplicar 70 nm de crómio e 300 nm de ouro à superfície.
   6. Armazene as lâminas revestidas de ouro sob argônio.

3. preparação da amostra

1. Prepare slides.
   1. Selecione um disco de ferro limpo (15 mm de diâmetro) e anexar um adesivo guia para ele.
   2. Solte o pedaço de tampa da guia adesivo.
   3. Selecione um pedaço de vidro limpo (a partir de seção 2.1.10) ou ouro (a partir de seção 2.2.7) e coloque-a firmemente sobre o lado pegajoso do disco ferro, este será o slide de amostra.
2. Proteína de depósito para slide.
   1. Dialize a poliproteína no buffer para o experimento (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 com 150 mM de NaCl) usando uma coluna de troca de amortecedor como um filtro centrífugo de 0,5 mL. Girar a proteína na coluna por 10 min a 13.000 rpm e, em seguida, inverter a coluna e eluir a proteína em um novo buffer por fiação a 1.000 rpm por 2 min.
   2. Determinar a concentração aproximada de proteína medindo a absorbância em 280 nm, utilizando um espectrofotômetro.
   3. Dilua a proteína 10-100 µ g/ml em um volume final de 100 µ l.
   4. Aplica a 60 µ l da solução da proteína para o centro do slide. Cuidado nesta fase para não deixar qualquer líquido entrar sob a lacuna entre o vidro e a corrediça de ferro, pois isso pode causar inchaço do adesivo durante o experimento e movimentos descontrolados amostra.
      Nota: Lâminas de ouro são hidrofóbicas, e uma gota esférica formarão, enquanto as lâminas de vidro são mais hidrofílicas e solução da proteína pode se espalhar.
   5. Deixe a amostra sentar-se à temperatura ambiente por 10-60 min. Durante este tempo, prossiga para o próximo passo para começar a configurar o microscópio de força atômica.

4. instalação de força atômica microscópio (AFM)

Nota: A seguir está uma descrição geral para a criação do AFM, e alguns detalhes específicos podem variar dependendo da instrumentação específica usada. A instrumentação usada é parcialmente construídos em casa e descrito em detalhes no Scholl¹³.

1. Monte o cantilever para uma célula AFM.
   1. Escolha o cantilever com propriedades adequadas para a aplicação. Uso de vigas com constantes de mola 4-10 pN/nm para baixas forças de desdobramento (~ 10-50 pN), enquanto o uso de vigas com constantes de mola 15-100 pN/nm para desdobramento de forças elevadas.
   2. Cuidadosamente pegar o cantilever da extremidade e coloque-o na cela a sonda.
   3. Certifique-se de que cela prende firmemente o cantilever no lugar antes de continuar.
   4. Lugar da cela na cabeça do AFM para alinhamento do laser.
2. Ajustar o laser na cabeça AFM.
   1. Coloque a cabeça para um microscópio invertido e conectar uma bateria na cabeça do AFM para alimentar o laser na cabeça.
   2. Colocar uma câmera para o detector de microscópio, para que a luz do laser pode ser visualizada em uma TV ou monitor.
   3. Posicione o laser para que localiza-se a ponta do cantilever
3. Monte a cabeça com a amostra.
   1. Irrigue 10 µ l de tampão em cada uma das portas da sonda a cela.
   2. Pegue o slide de exemplo que tem sido incubando e decantar 40 µ l de líquido a partir da solução incubada. Adicione 40 µ l de buffer no slide. Coloque o slide de amostra para o ímã acima o piezo.
   3. Certifique-se de que o estágio AFM está na posição elevada. Em seguida, coloque a cabeça AFM para o palco para que o cantilever AFM é acima da gota de amostra.
4. Centro do feixe de laser refletida para o fotodiodo.
   1. Cortar um pequeno pedaço de papel e coloque-o na frente do fotodiodo AFM.
   2. Reposicione o laser AFM usando os botões para que o ponto do laser no papel torna-se concentrado e brilhante.
   3. Ajuste o espelho do cabeça de AFM para que o laser atinge o fotodiodo para maximizar o sinal total em todos os quadrantes (A + B + C + D) e faz com que o sinal da diferença entre os dois principais e dois quadrantes para ser zero (A + B-C-D) de fundo.

5. calibração de microscópio de força atômica

1. Medir o espectro de potência.
   1. Sobre o filtro ligado para o AFM, ativar a configuração de filtro para o sinal de cabeça de AFM para largura de banda total.
   2. Sobre o AFM em si, certifique-se que o piezo é desligado como isto irá adicionar ruído ao sinal.
   3. Use o software AFM¹⁴ para medir a média de 512 cálculos do espectro de potência de pontos de dados de 1.024 por cálculo.
   4. Use o AFM software¹⁵ para integrar a densidade espectral de potência através do primeiro pico, o que corresponde ao principal modo de vibração para o cantilever.
2. Calcule a sensibilidade de fotodiodo.
   1. O AFM em si, ligue o controlador de piezo e altere a configuração de filtro para 500 Hz (filtro de passa-baixa).
   2. Monitore o sinal da diferença que deve estar flutuando em torno de zero no software AFM. Rapidamente mover a cabeça AFM para baixo alguns cem micrômetros usando micropositioners. Repetir a mover a cabeça para baixo e controlar o sinal de diferença para saltos consistentes. A superfície é muito nas proximidades quando salta o sinal começar a aumentar em altura.
   3. Assim que o sinal de deflexão satura em caso de contacto com a superfície, mova ligeiramente a cabeça longe da superfície.
   4. No software do AFM, use os controles de entrada para regular a voltagem de piezo para encontrar a superfície, movendo-se acima ou abaixo de 100-5.000 nm. Se a superfície não é ainda em reach, continue a reduzir a distância entre a cabeça e a amostra manualmente.
   5. No software do AFM, realizar um experimento puxando com um tamanho de digitalização de cerca de 500 nm para que a ponta entra em contato por cerca de 100 nm de viagens piezo.
   6. Medir a inclinação da região linear fotodiodo sinal contra piezo deslocamento da curva de onde a ponta do AFM permanece em contacto com a superfície do substrato.
   7. Calcular a constante de mola e sensibilidade, usando a inclinação e o espectro de potência integrado ().

6. aquisição de dados

1. Preparação.
   1. Sobre os filtros ligados para o AFM, defina a configuração de filtro para que a frequência de amostragem é de pelo menos duas vezes a largura de banda (critério de Nyquist), que vai dar um limite superior para o corte de passa-baixa.
2. Medições.
   1. Defina o tamanho de varredura para o tamanho total teórico do desdobramento poliproteína (número de aminoácidos × 0,365) mais cerca de 40% para permitir a pressionando contra o substrato. Por exemplo, puxar uma construção x I91 9 terá um comprimento teórico desdobrado de cerca de 300 nm, então o tamanho de digitalização deve ser cerca de 420 nm.
   2. No software do AFM, posicione o cantilever, de modo que é 80% do tamanho da digitalização, longe da superfície (neste caso, sobre a 340 nm longe da superfície).
   3. No software do AFM, defina a velocidade de varredura para 300 nm/s inicialmente.
      Nota: Esta velocidade pode ser modificada para ser mais lento ou mais rápido, dependendo da aplicação.
   4. Realizar um experimento puxando e medir a posição resultante do piezo e o sinal do fotodiodo. Use o software AFM para iniciar a digitalização.
   5. O software AFM, continue a realizar medições até há cerca de 10.000 gravações.
      Nota: Geralmente, a taxa de retirada de uma molécula controlado positivo é em torno de 0,5%¹⁶, então 10.000 são necessárias para ser capaz de coletar dados suficientes para analisar.

7. análise de dados

1. Normalize os dados.
   1. Para cada gravação, calcular a extensão de uso extensão = deslocamento - F/kc (kc é de 5.2.7).
   2. Determinar o nível de força de linha de base, tendo a média de início ou fim da rastreamento força-extensão, onde não há picos de força estão presentes e onde o cantilever não está pressionando contra a superfície. A curva de força-extensão inteira então pode ser deslocada por esse valor médio.
   3. Traduza os dados para que a extensão é alinhada ao longo do eixo y zero. Isso ocorre porque a molécula deve ser definida como zero extensão no início de um rastreamento.
2. Identificação da proteína de interesse.
   1. Identifica as gravações pelo menos quatro eventos I91 que fornecem uma impressão digital single-molécula. Estas gravações capturam verdadeiras "single-molécula medições".
   2. Salve a eventos que são denotados eventos único-molécula para uma análise mais aprofundada.
3. Determine o incremento de comprimento do contorno.
   1. Para cada gravação, caber um modelo do tipo worm cadeia ao desenrolar dos eventos, onde à temperatura, p é o comprimento de persistência (tipicamente de 0,4 a 1 nm), x é a extensão em nanômetros e L é o comprimento de contorno em nanômetros.
      Nota: Formulário da cadeia do tipo worm é uma solução interpolada para a exata, uma solução numérica mais exata é encontrada em Bouchiat et al ¹⁷. modelos alternativos de encaixe podem ser encontrados em Su et al . ¹⁸.
   2. Calcular a diferença entre os valores para L determinado por dois consecutivos desenrolar dos acontecimentos, e esta diferença é inventada o "incremento de comprimento do contorno".
4. Determine a força de ruptura.
   1. Calcule a força de ruptura para um determinado evento de desdobramento, tomando o ponto mais alto antes a maior queda na curva de desdobramento.

Resultados

Resultados representativos do presente protocolo são mostrados na Figura 2. Ambos os painéis mostram curvas força-extensão representativa das proteínas. A parte superior mostra os resultados uma poliproteína I91, enquanto a parte inferior mostra a proteína I91 flanqueando um proteína de interesse, a molécula de₁₀C NI. Estas gravações mostram o vigor característico do I91 (200 pN) e contorne o incremento de comprimento (28 nm) que indica...

Discussão

Um passo crítico no protocolo é a utilização de uma poliproteína, descrita na etapa 1.1.2, que serve como um controle positivo de "impressões digitais" single-molécula eventos. Geralmente, deve ser desdobramento eventos das proteínas poliproteína (para I91, isso significa uma força de desdobramento de cerca de 200 pN e contorno incremento de comprimento de cerca de 28 nm) para concluir inequivocamente que a proteína de interesse tem sido desdobrada. Por exemplo, quando a proteína de interesse é flanqueada po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter	Ted Pella, Inc.	16218	Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs	Ted Pella, Inc.	16079	Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM head
Glass probe holder	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.
Microlever AFM probes	Bruker Nano Inc.	MLCT	Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs	National Instruments	PCI-6259	Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface