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Resumo

Este protocolo mostra que o oxigênio hiperbárico pode aumentar a proliferação, inibição e apoptose de células de glioma U251 tratadas com irradiação de raios-X, bloqueando as células na fase G2/M. Isso melhora a radiossensibilidade das linhagens celulares de glioma humano.

Resumo

O objetivo deste estudo foi explorar o uso de oxigênio hiperbárico para aumentar a radiossensibilidade das células de glioma humano. As células de glioma humano U251 subcultivadas foram divididas aleatoriamente em quatro grupos: um grupo de controle não tratado, células tratadas apenas com oxigênio hiperbárico (HBO), células tratadas apenas com irradiação de raios-X (raios-X) e células tratadas com HBO e raios-X. Morfologia celular, atividade de proliferação celular, distribuição do ciclo celular e apoptose foram observadas nesses grupos para avaliar o papel da OHB na melhoria da radiossensibilidade das células de glioma. Com o aumento das doses de raios-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy), a fração de sobrevivência (SF) das células de glioma diminuiu gradualmente.

Observou-se SF significativamente menor para as células tratadas com HBO e raios-X juntos do que no grupo de raios-X para cada dose (todos P < 0,05). A inibição da proliferação foi significativamente maior no grupo HBO combinado com raios-X do que no grupo raios-X para cada dose (todos os P < 0,05) para a linhagem celular U251. A porcentagem de células da fase G2/M foi significativamente maior no grupo OHB combinado com raios-X (2 Gy) (26,70% ± 2,46%) e no grupo OHB (22,36% ± 0,91%) do que no grupo controle (11,56% ± 2,01%) e no grupo raios-X (2 Gy) (10,35% ± 2,69%) (todos P < 0,05). A apoptose de células U251 foi significativamente maior no grupo HBO combinado com raios-X (2 Gy) do que no grupo HBO, no grupo raio-X (2 Gy) e no grupo controle (todos P < 0,05). Concluímos que a HBO pode aumentar a proliferação, inibição e apoptose das células de glioma U251, bloqueando as células de glioma na fase G2 / M e melhorar a radiossensibilidade das células de glioma U251.

Introdução

O glioma é um tumor intracraniano primário que se origina das células gliais do sistema nervoso central1. A estratégia atual de tratamento para o glioma é a cirurgia combinada com radioterapia e quimioterapia. A radioterapia pós-operatória para glioma pode fornecer benefícios de sobrevida (evidência grau I), e a radioterapia pós-operatória precoce pode efetivamente prolongar a sobrevida do paciente (evidência grau II)2. Para gliomas de alto grau (grau III ou IV), especialmente glioblastoma altamente maligno e invasivo (evidência de grau III)3, a radioterapia pós-operatória deve ser realizada o mais cedo possível (<6 semanas). No entanto, apesar da intervenção precoce, o glioma ainda apresenta uma alta taxa de recorrência e mau prognóstico após tratamento abrangente. Esses resultados estão associados principalmente à baixa radiossensibilidade do glioma. Os fatores relacionados à radiossensibilidade tumoral incluem a radiossensibilidade inerente das células tumorais, células tumorais hipóxicas ou não hipóxicas, a proporção de células tumorais hipóxicas e a capacidade do tecido peritumoral de reparar danos causados pela radiação4.

Dentre esses fatores, as células tumorais hipóxicas ou não hipóxicas e a proporção de células tumorais hipóxicas têm efeitos importantes sobre a radiossensibilidade tumoral. O oxigênio hiperbárico (OHB) pode melhorar o armazenamento de oxigênio nos tecidos, aumentando a tensão de oxigênio nos tecidos e a difusão de oxigênio no sangue. A OHB também pode produzir uma série de efeitos bioquímicos, citológicos e fisiológicos benéficos5. Por exemplo, a OHB tem um efeito reparador marcante nos danos causados pela radiação induzida por radioterapia. Embora a OHB combinada com radioterapia ou quimioterapia seja relatada para melhorar a eficácia clínica da radioterapia ou quimioterapia para o glioma6, há um debate considerável sobre como a OHB sozinha afeta o crescimento do glioma maligno. Ding et al.7 e Wang et al.8 demonstraram que a OHB promove o crescimento de glioma in situ em camundongos por meio de mecanismos que envolvem a inibição da apoptose e a promoção da angiogênese tumoral. Em condições fisiológicas, a OHB promove a angiogênese tumoral por induzir estresse oxidativo9.

No entanto, um estudo indicou que a exposição a curto prazo à OHB promove a proliferação de células tumorais, enquanto a exposição prolongada à OHB promove a apoptose e inibe a proliferação10. Portanto, mais estudos são necessários para explorar se a OHB promove ou inibe o crescimento do glioma e como a OHB combinada com radioterapia ou quimioterapia pode induzir sensibilização terapêutica. Em particular, são necessários detalhes mecanicistas sobre como a HBO melhora a radiossensibilidade do glioma. Para explorar como a HBO melhora a radiossensibilidade das células de glioma U251 humanas neste estudo, usamos HBO combinada com irradiação de raios-X na proliferação de células de glioma e observamos os efeitos na distribuição do ciclo celular e na apoptose.

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Protocolo

Todos os métodos de estudo foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional e pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado à Universidade de Lanzhou e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes.

1. Tratamento de células de glioma

NOTA: A linha celular de glioma U251 foi usada neste experimento.

  1. Cultura de células U251
    1. Semeie células U251 em várias placas com DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e cultive-as a 37 ° C com 5% de CO2.
    2. Ao atingir 50%-60% de confluência, dissocie as células usando solução de tripsina-EDTA (0,25%, sem vermelho de fenol) e deixe-as crescer até 80% de confluência.
  2. Irradiação de raios X
    1. Cobrir as placas ou balões de cultura com um compensador tecidual equivalente com uma espessura máxima de 1 cm. Em seguida, exponha as células à irradiação de raios X fornecida por um acelerador linear de 6 MV com uma distância fonte-célula de 100 cm, ajustada clicando no botão de rotação na placa de controle remoto.
    2. Peça a um físico que meça a dose de radiação e corrija a atenuação. Como controle, coloque frascos contendo meios em um detector antes da irradiação de raios-X.
  3. Oxigênio hiperbárico (OHB)
    1. Desinfete a câmara HBO ligando a luz ultravioleta por 15 min e depois inunde-a com 0.02 MPa de oxigênio puro por 5 min.
    2. Depois de colocar as células em placas ou frascos de cultura na câmara, clique no botão regulador de pressão na placa de controle fora da câmara para aumentar a pressão HBO na câmara para 0.2 MPa (2.0 ATA) dentro de 30 minutos de irradiação.
    3. Trinta minutos depois, clique no botão regulador de pressão para diminuir a pressão HBO para o nível de pressão anterior (0.1 MPpa). Em seguida, trate os frascos ou placas de cultura com HBO 1x por dia durante 3 dias consecutivos.

2. Células de glioma U251 em diferentes grupos

  1. Defina um grupo de controle, grupo de raios-X (2 Gy) e HBO combinado com grupo de raios-X (2 Gy) para calcular as curvas de crescimento celular.
  2. Prepare suspensões unicelulares a partir das células do glioma U251 mostrando as taxas máximas de crescimento (consulte a etapa 1.1.2). Ajuste a densidade celular para 1 × 106 / mL contando as células usando uma lâmina de hemocitômetro. Em seguida, adicionar 1 ml da suspensão celular a um frasco de cultura (densidade celular: 1 × 106/frasco) com três frascos separados para cada grupo.
  3. Avalie a morfologia celular com ampliação de 100x com um microscópio de campo claro para enumerar as células aderentes em 24 h, 48 h e 72 h de cultura.

3. Radiossensibilidade das células de glioma U251 (ensaio de formação de clones) dentro de 30 minutos após HBO

  1. Semeie a suspensão unicelular U251 em todos os poços a 5 × 102 células/mL em placas de 6 poços e, em seguida, exponha-os à dose indicada de irradiação de raios-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy e 8 Gy), com três amostras paralelas sendo examinadas para cada dose de raios-X.
  2. Para o grupo HBO combinado com raios-X (2 Gy), exponha as células à irradiação de raios-X dentro de 30 minutos após o tratamento com OHB. Após o tratamento, cultivar as células a 37 °C com 5% de CO2 durante 14 dias.
  3. Depois que os clones estiverem visíveis, remova o meio e lave os clones 2x com PBS.
  4. Fixe as células em 1 mL de metanol a 10% por 15 min antes de corar com 1 mL de violeta cristal a 0,1% por 20 min.
  5. Após a coloração, lave as células com 6 mL de água destilada usando uma pipeta e, em seguida, aspire a solução de cristal violeta. Deixe as células secarem ao ar.
  6. Conte os clones com um diâmetro entre 0,3 mm e 1,0 mm ao microscópio para garantir que haja >50 células por clone.
  7. Calcular a fração de sobrevivência (SF) utilizando a equação (1):
    SF = figure-protocol-4252 × 100% (1)
  8. Usando software estatístico, gere uma curva de sobrevivência de dose de radiação com base no modelo multialvo de acerto único (SHMT) usando a equação (2):
    S = 1 - (1 - figure-protocol-4567)N (2)
    Onde S = probabilidade de sobrevivência; k = dose letal média (a dose que causa uma resposta positiva média por célula); x = o número de ocorrências por célula; N = o número de alvos (o número de acertos para morte celular).
  9. Calcule os parâmetros radiobiológicos, incluindo a dose letal média (D0), dose quase-limiar (Dq), número de extrapolação (N), fração de sobrevivência em uma dose de irradiação de 2 Gy (SF2), taxa de aumento de sensibilização (D0) (SER = D0 no grupo controle / D0 no grupo experimental) e SER (Dq) (SER = Dq no grupo controle / Dq no grupo experimental) para avaliar o efeito da HBO na radiossensibilidade das células de glioma U251.
    Em que D0 = valor recíproco da inclinação da porção linear da curva de sobrevivência (a dose reduz a taxa de sobrevivência em 63%)
    N = o valor do ponto de interseção formado pela extrapolação da porção linear para encontrar a ordenada (refletindo a capacidade celular de reparar o dano causado pela radiação)
    Dq = valor do ponto projetivo de intersecção na abscissa e da intersecção formada pelo desenho de uma linha que passa por 1,0 na ordenada e paralela à abscissa para encontrar a recta de extrapolação.

4. Ensaio de contagem de células para avaliar a proliferação de células de glioma U251

  1. Defina um grupo de controle, um grupo HBO e grupos tratados com raios-X (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) sozinho ou combinado com HBO.
  2. Ajuste a densidade celular para 1 × 104 células/mL usando células U251 em suspensões unicelulares.
  3. Semeie as suspensões celulares (100 μL, densidade: 1 × 103 / poço) em placas de 96 poços (cinco poços por grupo). Efectuar o ensaio de contagem de células (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, determinar a densidade óptica (DO) a 450 nm utilizando um leitor de microplacas após 48 h de cultura com o reagente.
  4. Calcular a taxa de inibição da proliferação celular (IR) de acordo com a equação (3):
    IR = figure-protocol-6839 × 100% (3)

5. Detecção de apoptose de células de glioma U251

  1. Controle de conjunto, HBO, raio-X (2 Gy) e HBO combinados com grupos de raios-X (2 Gy).
  2. Remova o meio após a cultura e lave as células com 1x PBS.
  3. Separe as células com tripsina e, em seguida, desative a tripsina adicionando DMEM quando uma morfologia celular arredondada for observada ao microscópio.
  4. Transferir as células para um tubo de centrifugação e centrifugar durante 5 min a 200 × g.
  5. Descarte o sobrenadante, adicione 3 mL de 1x PBS ao pellet e pipete suavemente para ressuspender as células.
  6. Centrifugue as células novamente a 200 × g por 5 min. Em seguida, aspire o PBS sobrenadante e lave as células 2x antes de ressuspendê-las com pipetagem suave em 50 μL de tampão de ligação.
  7. Adicione 5 μL de anexina V-FITC às células a 4 ° C e incube as células no escuro a 4 ° C por 15 min antes de adicionar 400 μL de tampão de ligação. Transferir a mistura para um tubo de citometria de fluxo contendo 5 μl de solução de corante de iodeto de propídio (PI) (10 mg/ml). Detecte células apoptóticas 5 min depois por citometria de fluxo11.
  8. Registre a fluorescência vermelha na onda de excitação de 488 nm, insira-a em um computador para analisar a porcentagem de cada ciclo celular em 5.000 células e, em seguida, imprima os picos das células apoptóticas.
  9. Colete a fluorescência vermelha e verde por anexina V e rotulagem dupla PI, insira-as no computador para analisar e, em seguida, imprima o gráfico de pontos.

6. Detecção da distribuição do ciclo celular do glioma U251

  1. Lave as células mencionadas acima 2x com 1 mL de PBS antes de tratá-las com tripsina.
  2. Quando uma morfologia celular arredondada for detectada por microscopia de luz, adicione DMEM contendo 10% de FBS.
  3. Centrifugue as células por 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
  4. Remova o sobrenadante e ressuspenda essas células em 1 mL de PBS antes de adicionar solução pré-resfriada de etanol a 75%.
  5. Incubar a mistura durante pelo menos 4 h ou durante a noite a -20 °C.
  6. Lave as células 2x com PBS gelado e 180 μL de EDTA (0,1 mM, 3,7 mg de EDTA + 100 mL de PBS), 20 μL de RNase A (10 mg/mL), 35 μL de Triton X-100 (2%, 2 mL de Triton + 98 mL de FBS) e 96,5 μL de PBS. Em seguida, adicione 17,5 μL de solução de IP (1 mg/mL).
  7. Incubar a mistura a 4 °C na escuridão durante 10 min.
  8. Lave as células em 200 μL de PBS e, em seguida, coloque-as em um citômetro de fluxo para avaliar a distribuição do ciclo celular, conforme descrito anteriormente12.
  9. Opere o citômetro de fluxo no modo de excitação de laser duplo, espaço tridimensional, com um tamanho de ponto de 22 μm x 66 μm e 13 μm x 66 μm. Use uma sala de fluxo de 430 μm x 180 μm, espectro de 300-1.100 nm, detectabilidade ≤100 MESF e resolução CV <2%. Em seguida, exponha as células à luz de excitação de 488 nm e detecte e meça os sinais de fluorescência com o software do instrumento para determinar a distribuição do ciclo celular13.
  10. Determine o conteúdo de DNA e, de acordo com o conteúdo de DNA, analise o ciclo celular.

7. Análise estatística

  1. Realizar análises estatísticas.
  2. Apresente os dados como média ± desvio padrão.
  3. Utilizar o teste t de Student para comparar os grupos, com significância estatística definida como P < 0,05.

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Resultados

Cultura de células de glioma U251
As células de glioma U251 apresentaram formato fusiforme 24 h a 48 h após o cultivo em DMEM e foram aderentes. Essas células foram utilizadas para estudo posterior (Figura 1).

Morfologia e contagem de células de glioma
As contagens de células para as células de glioma U251 no grupo HBO combinado com raios-X (2 Gy) foram significativamente menores do q...

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Discussão

A linhagem celular de glioma U251 é uma das linhagens celulares de glioma humano mais clássicas e é amplamente utilizada como modelo de glioma em muitos estudos.

Efeitos da OHB na proliferação de células de glioma U251
HBO normalmente se refere à respiração de oxigênio puro (concentração de oxigênio de 100%) em uma câmara selada com uma pressão 1,5-3 vezes maior que a pressão atmosférica normal, o que pode aumentar o conte?...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Nenhum.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Binding Buffer  Dickinson and CompanyRH10 9RR
CCK-8 test kit DOJINDO NJCell counting assay
CELL FIT cell cycle analysis (DNA content)
CELLQUESTapoptotic cell analysis
DMEM and Annexin V-FITCGibco BRL
flow cytometerDickinson
Glioma U251 and U87 cell lineShanghai Institute of Cell Biology
hyperbaric oxygen chamberHongyuan Institute
medical linear acceleratorElekta Limited Company
microplate reader
MOD FITLT formac v1.01 cell analysis--cell cycle phase
trypsinHyclone Laboratories Inc

Referências

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