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Resumo

Descrevemos novas metodologias simples de síntese e caracterização de partículas micro e submicrônicas de lignina biocompatíveis. Essas formulações fornecem uma abordagem fácil para a utilização do heteropolímero, bem como uma alternativa para o projeto racional de matrizes carreadoras multifuncionais com potencial aplicabilidade em biomedicina, tecnologia farmacêutica e indústria alimentícia.

Resumo

A aplicabilidade da micro/nanotecnologia de biopolímeros em medicina humana, veterinária, farmacêutica e alimentícia está crescendo rapidamente devido ao grande potencial das partículas baseadas em biopolímeros como sistemas de transporte eficazes. O uso da lignina como biomatriz heteropolimérica básica para o projeto de formulações micro/submicrométricas inovadoras permite a obtenção de maior biocompatibilidade e oferece vários grupos funcionais ativos apresentando oportunidades para personalização das propriedades físico-químicas e bioatividades das formulações para diversas aplicações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver uma metodologia simples e ecologicamente correta para a síntese de partículas de lignina com tamanho micro e submicrométrico; avaliar suas características físico-químicas, espectrais e estruturais; e examinar sua capacidade de encapsulamento de moléculas biologicamente ativas e potencial de liberação in vitro de bioflavonóides em meios gastrointestinais simulados. As metodologias apresentadas aplicam solventes baratos e verdes; processos fáceis, diretos, rápidos e sensíveis que requerem pouco equipamento, substâncias não tóxicas e métodos simples para sua caracterização, a determinação da capacidade de encapsulação dos compostos bioativos pouco solúveis em água morin e quercetina, e o potencial de liberação in vitro das matrizes de lignina.

Introdução

Atualmente, a inclinação para biopolímeros como celulose, quitosana, colágeno, dextrana, gelatina e lignina como precursores para o projeto de transportadores micro/submicrométricos com tamanho, propriedades físico-químicas e biofuncionalidades personalizáveis aumentou nas indústrias biomédica, farmacêutica e de tecnologia de alimentos devido à sua aplicabilidade em engenharia de tecidos, bioimpressão 3D, in vitro plataformas de modelagem de doenças, indústria de embalagens, preparação de emulsões e entrega de nutrientes, entre outros 1,2,3.

Novos estudos destacam os aspectos dos hidrogéis à base de lignina, bem como das micro e nanoformulações4 como veículos vantajosos usados para materiais de embalagem de alimentos5, armazenamento de energia6, cosméticos7, estabilizadores térmicos/leves, materiais reforçados e matrizes transportadoras de medicamentos8 para a entrega de moléculas hidrofóbicas, melhoria das barreiras UV9, como agentes de reforço em nanocompósitos, e como alternativa às nanopartículas inorgânicas devido a alguns problemas de segurança recentes 10,11,12. A razão por trás dessa tendência é a biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade do heterobiopolímero natural, bem como suas bioatividades comprovadas de potencial antioxidante de lignina e atividades antiproliferativas e antimicrobianas 13,14,15,16,17.

A literatura científica relata vários métodos de síntese (automontagem, precipitação anti-solvente, precipitação ácida e deslocamento de solvente)18 e caracterização de formulações à base de lignina em escala micro/nano, incluindo a aplicação de solventes caros ou prejudiciais, como tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF) e acetona, e processos complicados, indiretos e tediosos que usam muitos equipamentos e substâncias tóxicas 12,19,20.

Para superar as últimas desvantagens, os seguintes protocolos apresentam novas metodologias para a síntese de partículas micro/submicrônicas à base de lignina usando solventes baratos e verdes; Processos fáceis, diretos, rápidos e sensíveis, exigindo poucos equipamentos, substâncias não tóxicas e métodos simples para sua caracterização e determinação da capacidade de encapsulação de compostos bioativos pouco solúveis em água e potencial de liberação in vitro das matrizes de lignina. Os métodos de produção em escala laboratorial apresentados são vantajosos para a fabricação de carreadores de lignina funcionais com tamanhos ajustáveis, alta capacidade de encapsulação e comportamento de liberação in vitro sustentável, utilizando procedimentos simples de caracterização e produtos químicos ecologicamente corretos que podem encontrar aplicação em várias áreas das ciências biomédicas e tecnologia de alimentos. Dois flavonóides foram aplicados como moléculas-alvo encapsuladas nas partículas de lignina: morina-nas micropartículas e quercetina-nas partículas submicrônicas. A diferença nas estruturas de ambos os flavonóides é apenas a posição do segundo grupo -OH no anel B-aromático: o grupo -OH está na posição 2' na morina e na posição 3' na quercetina, portanto, ambos os compostos orgânicos são isômeros posicionais. Este último fato pressupõe comportamento semelhante de ambos os compostos naturais bioativos nos processos de encapsulamento e/ou liberação.

Protocolo

1. Síntese de micropartículas de lignina

  1. Preparar uma solução aquosa de lignina alcalina a 50 mg/ml dissolvendo 2,5 g de lignina alcalina em 50 ml de água ultrapura num agitador magnético.
  2. Prepare a solução de Tween 80 a 1% dissolvendo 1 mL de Tween 80 em 100 mL de água ultrapura.
  3. Prepare uma solução 2 M de HNO3 diluindo 6,65 mL de 67% de HNO3 (densidade = 1,413 g / mL) com água ultrapura até um volume final de 50 mL.
  4. Adicione lentamente 15 mL da solução Tween 80 a 1% a 50 mL da solução alcalina de lignina a 50 mg / mL.
  5. Agitar a mistura num agitador magnético a 500 rpm durante 10 min para que o tensioactivo fique bem disperso.
  6. Adicione 20 mL de 2 M HNO3 gota a gota com uma seringa a uma taxa de fluxo de aproximadamente 150 μL / s à mistura.
  7. Continue mexendo a mistura por 30 min quando a solução marrom escura for transformada em uma suspensão marrom clara de micropartículas.
  8. Transfira a suspensão para tubos de ensaio de 1,5-2 mL e centrifugue por 30 min a 15.000 × g em uma ultracentrífuga a 10 °C.
  9. Recolha o sobrenadante para análises posteriores e lave as micropartículas com água ultrapura.
  10. Repita os procedimentos de enxágue/ultracentrifugação 3x.
  11. Mergulhe o recipiente com as micropartículas em um banho de gelo antes da homogeneização ultrassônica.
  12. Homogeneizar as micropartículas por 4 min a uma intensidade de 93% em um homogeneizador de ultrassom.
  13. Liofilize as micropartículas a uma temperatura de -64 °C em um liofilizador e armazene-as em um exicador para uso posterior.

2. Síntese de partículas submicrônicas de lignina

  1. Preparar uma solução aquosa de lignina alcalina a 5 mg/ml dissolvendo 125 mg de lignina alcalina em 25 ml de água ultrapura num agitador magnético.
  2. Adicione lentamente 1 mL de EtOH a 96% à solução alcalina de lignina.
  3. Agite a mistura em um agitador magnético a 500 rpm por 3 min.
  4. Prepare 50 mL de uma solução de ácido cítrico a 1% dissolvendo 0,5 g de ácido cítrico em água ultrapura até um volume final de 50 mL.
  5. Adicione 7 mL de ácido cítrico a 1% gota a gota com uma seringa a uma taxa de fluxo de aproximadamente 4 mL / min à mistura.
  6. Continue mexendo a mistura por 10 minutos quando a solução marrom clara se transformar em uma suspensão marrom clara turva de partículas submicrônicas.
  7. Transferir a suspensão para tubos de ensaio e centrifugar durante 30 min a 15.000 × g numa ultracentrífuga a 10 °C.
  8. Recolha o sobrenadante para análises posteriores e lave as micropartículas com água ultrapura.
  9. Repita os procedimentos de enxágue/ultracentrifugação 3x.
  10. Mergulhe o recipiente com as micropartículas em um banho de gelo antes da homogeneização ultrassônica.
  11. Homogeneizar as micropartículas por ultrassom por dois ciclos de 4 min cada a uma intensidade de 96% em um homogeneizador de ultrassom.
  12. Resfrie os recipientes por 1 min após o primeiro ciclo.
  13. Liofilize as micropartículas a uma temperatura de -64 °C em um liofilizador e armazene-as em um exicador para uso posterior.

3. Síntese de partículas micro/submicrônicas de lignina encapsuladas em flavonóides naturais

  1. Repita as etapas 1.1-1.5 para as micropartículas.
  2. Pesar 0,08 g de morin, dissolver em 1 ml de EtOH e adicionar esta solução etanólica à mistura.
  3. Agite a mistura em um agitador magnético a 500 rpm por 20 min.
  4. Adicione 20 mL de 2 N HNO3 gota a gota com uma seringa a uma taxa de fluxo de aproximadamente 150 μL / s à mistura.
  5. Continue mexendo a mistura por 60 min.
  6. Repita as etapas 1.8-1.13.
  7. Repita a etapa 2.1 para as partículas submicrônicas.
  8. Pesar 0,04 g de quercetina, dissolver em 1 mL de EtOH e adicionar esta solução etanólica à solução aquosa de lignina alcalina.
  9. Agite a mistura em um agitador magnético a 500 rpm por 10 min.
  10. Repita as etapas 2.4-2.13.

4. Determinação da eficiência de encapsulação de micro / sumicropartículas de lignina

  1. Calcular o teor da substância bioactiva adicionada durante o procedimento de síntese de ambos os tipos de partículas de lignina encapsuladas em flavonóides.
    1. Determinar espectrofotometricamente a absorção do flavonóide no sobrenadante obtido durante as etapas 1.9 e 2.8 após diluição com EtOH a 96%.
    2. Calcular a concentração da morina/quercetina não aprisionada utilizando as curvas de calibração dos flavonóides.
    3. Calcular a eficiência de encapsulação (EE, %) das micropartículas de lignina em relação aos flavonóides naturais utilizando a equação (1):
      figure-protocol-4991Características (1)
      Em que wo é a quantidade total da substância bioativa adicionada (mg) e wf é a quantidade de flavonóide (mg) livre não aprisionado.
    4. Calcule a capacidade de carga de medicamentos (DLC, %) - um parâmetro importante que representa a quantidade de medicamentos nas partículas por unidade de peso do sistema transportador - usando a eq. (2):
      figure-protocol-5509(2)
      Onde wp é a quantidade total (rendimento) de partículas de lignina micro/submicrônica obtidas após liofilização (mg).

5. Caracterização de partículas micro e submicrônicas de lignina

  1. Determinação do número de partículas, tamanho e distribuição de tamanho
    1. Avalie o tamanho das partículas e a distribuição do tamanho das partículas das amostras usando um contador automático de células com a opção de contagem de contas. Adicionar com uma micropipeta 1 μL da suspensão de partículas micro/submicrônicas de lignina/flavonóide em água ultrapura no poço da lâmina de contagem necessária para a operação.
    2. Aguarde até que o número de partículas em 1 mL da suspensão, bem como seu número e distribuição por tamanho sejam mostrados no display do contador automático de células.
      NOTA: O aparelho permite o armazenamento dos dados em um flash USB. O software especial do contador automático de células permite o processamento adicional dos arquivos digitais e fotográficos salvos.
  2. Determinação do teor de grupos ácidos/básicos de superfície de partículas de lignina por titulação potenciométrica
    1. Peso 0,04 g de partículas de lignina não carregadas/encapsuladas em flavonóides.
    2. Transferi-los para um Erlenmeyer, adicionar 10 ml de HCl 0,1 M e colocar o balão num agitador magnético a 250 rpm.
    3. Encha uma bureta de 50 mL com uma solução-padrão 0,1 M do titulante NaOH.
    4. Medir o pH inicial da solução no erlenmeyer com um medidor de pH de bancada antes de iniciar a titulação.
    5. Inicie a titulação e meça o pH da solução analisada após cada porção adicionada de 0,5 mL do titulante.
    6. Armazene os dados experimentais em uma tabela contendo o volume do titulante aplicado e o valor correspondente de pH.
    7. Pare a titulação quando um valor aproximadamente constante do pH for atingido aumentando o volume da solução titulante.
    8. Traçar os dados experimentais sob a forma de curvas de titulação diferenciais zero, primeira e segunda derivadas.
    9. Determinar os pontos equivalentes e os volumes equivalentes correspondentes dos titulantes utilizados.
    10. Calcule o conteúdo dos grupos básicos ácidos A, ae Abna superfície de partículas de lignina carregadas e carregadas com flavonóides usando as equações (3) e (4):
      figure-protocol-8113 , mgeq/g (3)
      figure-protocol-8235 mgeq/g (4)
      Onde Veqi é o volume equivalente (mL); NT a normalidade do titulante (mgeqv/mL); VT o volume do titulante utilizado para o procedimento de determinação (ml); m peso da amostra analisada (g).
  3. Determinação do ponto de pH de carga zero (pHPZC) de partículas à base de lignina pelo método de adição sólida.
    1. Prepare 60 mL de solução aquosa 0,1 M de NaCl.
    2. Adicionar 9 ml da solução de NaCl 0,1 M em cada um dos cinco frascos cónicos tapados e ajustar o pH para pHi = 2, 4, 7, 10 e 12 (em que i = 1-5 indica o número da solução correspondente), respectivamente pela adição de HCl 0,1 M ou NaOH 0,1 M. Ajustar o volume total da solução em cada balão para 10 ml exactamente, adicionando solução de NaCl com a mesma dosagem.
    3. Adicionar 40 mg de partículas de lignina secas (micro/submicrônicas carregadas de flavonóides sem carga) a cada balão e tampar bem os frascos.
    4. Fixar os frascos na posição vertical num agitador orbital e mantê-los agitados durante 24 h.
    5. Deixar o equilíbrio durante 30 minutos e, em seguida, medir o pH final (pHf) dos sobrenadantes em cada balão.
    6. Representar graficamente os valores de pHf em relação aos valores de pH iniciais correspondentes (pHi).
    7. O ponto de carga zero (pHPZC) é definido como o valor do pH no qual a curva ΔpH versus pHi cruza a linha reta com coordenadas (pHi; pHi).
  4. Determinação do teor de fenólicos totais (TPC) de partículas de lignina
    NOTA: O conteúdo fenólico total (TPC) das partículas de lignina micro/submicrônica é determinado por meio de um método colorimétrico de Folin-Ciocalteu modificado.
    1. Misturar 200 μL de uma suspensão aquosa de partículas com uma concentração de 500 μg/ml com 600 μL de água ultrapura e 200 μL de reagente Folin-Ciocalteu (1:1, v/v).
    2. Após 5 min, adicione 1,0 mL de 8% de Na2CO3 e 1,0 mL de água Milli-Q à mistura e incube-a no escuro a 40 °C por 30 min em banho-maria com agitação intermitente.
    3. Centrifugue a suspensão a 5.300 × g por 2 min.
    4. Prepare um espaço em branco sem partículas.
    5. Transferir 3,5 ml do sobrenadante para uma cubeta de quartzo de 10 mm e medir a absorvância num espectrofotómetro UV/Vis na região visível a 760 nm em relação ao branco.
    6. Preparar uma curva de calibração do ácido gálico padrão seguindo os passos 5.3.1-5.3.5; apenas em vez de 200 μL da suspensão de partículas de lignina, usar a solução etanólica de ácido gálico com concentrações iniciais de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 e 200 μg/mL.
    7. Expresse os dados experimentais das micropartículas em mg de equivalentes de ácido gálico em miligramas por grama de amostra seca (mg GAE/g).
    8. Calcular o TPC utilizando a equação (5):
      figure-protocol-11332 mg GAE/g (5)
      Em que CGA é a concentração da amostra equivalente à concentração do ácido gálico padrão obtida a partir do gráfico de calibração do ácido (μg GA/ml); Cs é a concentração da amostra, que é igual à massa da amostra seca dividida pelo volume do solvente (μg/ml).

6. Determinação da capacidade de libertação in vitro de partículas de lignina

  1. Prepare 250 mL de meio gástrico livre de enzimas simulado ajustando o pH da solução padrão de PBS com HCl 0,1 M para pH = 1,2.
  2. Prepare 250 mL de cada uma das duas soluções de fluido intestinal simuladas, ajustando o pH da solução padrão de PBS com 0,1 M NaOH / 0,1 M HCl para pH = 6,8 e 7,4, respectivamente.
  3. Adicionar 25 mg de partículas micro/submicrônicas encapsuladas em flavonóides a 50 ml do meio gástrico sem enzimas simulado num reator de vidro fornecido com um agitador mecânico e colocá-lo em banho-maria termal a uma temperatura constante de T = 37 ± 0,2 oC.
  4. Mergulhe o agitador a uma profundidade de 2/3 do volume do líquido para garantir a mistura completa das fases sólida e líquida e garantir a transferência máxima de massa sem zonas estagnadas.
  5. Retire 1 mL de amostra do reator a cada 10 min até o90º min e pipete imediatamente 1 mL de solução fluida simulada fresca no reator para evitar a alteração do volume total e para garantir as condições de afundamento.
  6. Repita o mesmo procedimento, incluindo as etapas 6.3-6.6, com ambas as soluções de fluido intestinal simuladas com pH = 6.8 e 7.4, respectivamente, por 200 min.
  7. Realizar experimentos análogos com partículas de lignina descarregadas nos três meios simulados e usar as amostras como espaços em branco para zerar o espectrofotômetro.
  8. Determinar espectrofotometricamente a absorção das amostras após filtrá-las e diluí-las com EtOH a 96% em relação às amostras em branco da etapa 6.7 e calcular a concentração de flavonóides correspondente usando as curvas de calibração correspondentes de morin obtidas em pH = 1,2, 6,8 e 7,4, respectivamente.
  9. Calcular a libertação cumulativa (CR) dos bioflavonóides utilizando a equação (6) em μg/ml e a percentagem de libertação cumulativa (PCR) pela equação (7):
    figure-protocol-13829(6)
    Em que Ci e Ci+1 são as concentrações de morina/quercetina nasi-ésima e (i+1)ésima amostras (μg/ml); Vs o volume de amostra retirado do reator em batelada (mL); V o volume total do meio simulado (mL).
    figure-protocol-14183(7)
    Onde Cmax é a concentração máxima do composto biologicamente ativo no transportador (μg/mL).

7. Análises estatísticas

  1. Expresse os dados experimentais como médias ± desvios padrão (DP) de três medições independentes.
  2. Determine a significância estatística dos resultados experimentais realizando o teste ANOVA como teste post hoc. Considere-se um valor de p < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Uma técnica de precipitação anti-solvente foi executada para produzir partículas alcalinas de lignina micro/submicrônica. Uma solução aquosa de ácido inorgânico diluído-ácido nítrico/ácido orgânico-ácido cítrico foi dispersa em uma solução aquosa de lignina alcalina, enriquecida com um surfactante/etanol ecologicamente correto, o que resultou na precipitação gradual do soluto do biopolímero e, após a sonicação, uma suspensão de partículas compactas de micro/submícron foi finalmente produzida (<...

Discussão

Entre as principais questões críticas das modernas metodologias de síntese para o projeto de formulações de carreadores de fármacos à base de biopolímeros está a aplicação de reagentes orgânicos perigosos - solventes voláteis e inflamáveis, como tetrahidrofurano, acetona, metanol e até DMSO em altas concentrações - o que limita sua aplicabilidade na biomedicina, indústria farmacêutica e tecnologia de alimentos devido à manifestação de possíveis efeitos tóxicos20,

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Fundo Científico da Bulgária sob o Contrato nº KΠ-06 H59/3 e pelo Projeto Científico nº 07/2023 FVM, Universidade de Trakia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
automatic-cell counterEVE, NanoEnTek
Citric acidSigma251275 ACS reagent, ≥99.5%
digital water bathMemmert
Eppendorf tubes, 1.5-2 mL
EthanolSigma34852-Mabsolute, suitable for HPLC, ≥99.8%
Folin–Ciocalteu’s phenol reagentSigmaF9252
 freeze dryerBiobase
gallic acidSigma-BCBW7577monohydrate
HClSigma258148ACS reagent, 37%
HNO3Sigma438073 ACS reagent, 70%
lignin, alkaliSigma370959
morinSigmaPHL82601
NaClSigmaS9888ACS reagent, ≥99.0%
Na2CO3Sigma223530powder, ≥99.5%, ACS reagent
NaOHSigma655104reagent grade, 97%, powder
orbital shakerIKAKS 130 basic
pH-meterConsort
phosphate-buffered saline (PBS)SigmaRNBH7571
Quercetin hydrateSigmaSTBG3815V
statistical software for ExcelMicrosoft CorporationXLSTAT  Version 2022.4.5.
Tween 80SigmaP8074BioXtra, viscous liquid
ultracentrifugeHermleZ 326 K
Ultrapure water systemAdronaINTEGRITY+
ultrasound homogenizerBandelin SonopulsHD 2070
UV/Vis spectrophotometerHach-LangeDR 5000

Referências

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