Medições de batimentos cardíacos sem anestesia em peixe-zebra em movimento livre

Resumo

O estudo visa desenvolver tecnologia para medições de batimentos cardíacos sem anestesia em peixes-zebra em movimento. Nossa abordagem combina imagens infravermelhas de ondas curtas e rastreamento do coração baseado em aprendizado de máquina. É uma técnica não invasiva, sem rótulos e fácil de usar que se adapta a uma ampla gama de estudos sobre o modelo de peixe-zebra.

Resumo

O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo modelo amplamente utilizado em pesquisas fisiológicas, farmacológicas e toxicológicas devido à sua semelhança genética com humanos e estágio embrionário transparente, o que facilita estudos cardiovasculares não invasivos. No entanto, os métodos atuais de avaliação da frequência cardíaca em peixe-zebra muitas vezes dependem da anestesia para imobilizar o sujeito, introduzindo alterações fisiológicas que comprometem a precisão e a reprodutibilidade dos dados. Este estudo apresenta uma nova técnica sem anestesia para medir os batimentos cardíacos em larvas de peixe-zebra em movimento livre, abordando uma limitação crítica na pesquisa cardiovascular. A abordagem proposta integra imagens infravermelhas de ondas curtas com rastreamento cardíaco baseado em aprendizado de máquina, permitindo o monitoramento preciso e contínuo da atividade cardíaca em espécimes não imobilizados. Uma rede neural convolucional foi treinada para detectar a região do coração e um sinal fotopletismográfico foi extraído das sequências de imagens para determinar a frequência cardíaca. A validação experimental demonstrou a confiabilidade e consistência do método em várias condições de teste. Um dos principais benefícios da metodologia é sua capacidade de preservar o estado fisiológico natural do peixe-zebra, minimizando os artefatos induzidos pelo estresse. Essa técnica não invasiva e sem rótulo oferece vantagens significativas para o estudo da fisiologia cardiovascular, cardiotoxicidade de drogas e toxicologia ambiental, expandindo as aplicações potenciais do peixe-zebra como modelo para pesquisa biomédica.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio), um pequeno peixe ciprinídeo, tornou-se um organismo modelo essencial devido ao seu pequeno tamanho, alta taxa reprodutiva e facilidade de manipulação genética ^1,2,3. A avaliação da freqüência cardíaca em embriões transparentes de peixe-zebra é cada vez mais utilizada em fisiologia, embriologia, toxicologia e outros campos 4,5,6,7,8. Por um lado, essa utilidade se deve ao fato de que o genoma do peixe-zebra inclui genes associados a doenças cardiovasculares humanas⁹, e o coração Danio rerio compartilha estruturas e vias de sinalização semelhantes com os humanos^10,11. Isso torna o peixe-zebra um modelo inestimável para estudar o desenvolvimento e as doenças do coração 11,12,13. Por outro lado, a frequência cardíaca do peixe-zebra é sensível a influências externas, tornando-se um excelente modelo para estudos fisiológicos e toxicológicos, comparando a função cardíaca em peixes tratados e não tratados ^7,8,14.

Progressos significativos foram feitos no desenvolvimento de métodos ópticos não invasivos para avaliar a frequência cardíaca em embriões de peixes transparentes^15,16. Essas técnicas oferecem a vantagem de uma coleta rápida de dados de grandes tamanhos de amostra. Consequentemente, abordagens totalmente automatizadas para avaliação da frequência cardíaca em embriões de peixes foram desenvolvidas 4,5,6,17.

No entanto, certas limitações atualmente restringem o uso dessas técnicas ao período de 3-4 dpf. A primeira limitação é a perda de transparência devido à pigmentação do corpo do peixe. A segunda é o aumento da mobilidade dos embriões ao longo do tempo. Estender o período de desenvolvimento inicial do peixe-zebra durante o qual as abordagens ópticas podem ser usadas aumentaria sua utilidade, permitindo projetos experimentais de longo prazo para estudar cardiomiopatia, defeitos cardíacos congênitos e vários impactos no sistema cardiovascular, incluindo o rastreamento da dinâmica dos efeitos ao longo do tempo. Nosso grupo recentemente abordou a questão da perda de transparência empregando imagens na faixa de infravermelho de ondas curtas de 900-1700 nm¹⁸. Este artigo se concentra em abordar a questão da mobilidade embrionária.

Normalmente, anestésicos como o metanossulfonato de tricaína (MS-222) são usados para imobilizar embriões e larvas de peixes nadando livremente antes da imagem 14,19,20. No entanto, o MS-222 reduz significativamente a freqüência cardíaca^21,22, assim como outros anestésicos²³. Torna-se um desafio discernir se as alterações observadas na função cardíaca são devidas ao tratamento experimental, ao anestésico ou a uma interação entre os dois. Outra maneira de estender o período de baixa mobilidade do embrião é reduzindo a temperatura durante o desenvolvimento inicial⁸. No entanto, essa abordagem nem sempre é compatível com os objetivos da pesquisa e apenas estende minimamente o período de inscrição.

Neste estudo, apresentamos um novo método para abordar a mobilidade embrionária durante o registro da frequência cardíaca. Treinamos uma rede neural convolucional para identificar a região de interesse do coração em registros de embriões de peixe-zebra nadando livremente. A variação periódica na intensidade do pixel dentro desta área é utilizada para derivar o fotopletismograma (PPG), que é posteriormente usado para calcular a frequência cardíaca. O aplicativo de desktop desenvolvido, AutoHR, utilizou treinamento de rede neural e processamento de pilha de imagens, garantindo facilidade de uso e reprodutibilidade do protocolo.

Protocolo

Os peixes-zebra foram criados e criados de acordo com os protocolos ZFIN estabelecidos²⁴. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Bioética do Centro Científico e Tecnológico de Instrumentação Única da Academia Russa de Ciências (STC UI RAS), protocolo #3/24, datado de 21/08/2024, e seguem as diretrizes de cuidados com o peixe-zebra do STC UI RAS. Manuais para versões individuais estão disponíveis mediante solicitação.

1. Preparação do equipamento para medição

1. Seleção de equipamentos
   1. Escolha uma fonte de luz: Escolha uma fonte de luz LED que emita na faixa do infravermelho próximo, especificamente a partir de 800 nm, com uma potência mínima de 3 W. Este estudo utilizou LED com comprimento de onda central de 940 nm e largura de banda de 40 nm.
   2. Escolha uma câmera de vídeo: Escolha uma câmera equipada com um sensor sensível à faixa de comprimento de onda emitida pela fonte de luz e tenha uma taxa de quadros de pelo menos 60 fps. Consulte a folha de dados da câmera para determinar a distância entre pixels p, o tamanho do sensor ao longo de seu lado mais curto h e a taxa de quadros. Neste estudo, a câmera tem uma densidade de pixels de p = 5 μm e uma largura do sensor h = 5,12 mm.
   3. Escolha um tamanho de molde de agarose que seja pelo menos 1,5 vezes maior que o comprimento da larva B. Calcule as ampliações mínimas e máximas permitidas do sistema óptico usando as expressões fornecidas. Certifique-se de que M_max ≤ M_min. Se esta condição não for atendida, selecione uma câmera com um h maior e/ou um S menor e/ou menor.
      
      
      onde S_max é o comprimento do maior molde de agarose do conjunto de moldes. Um conjunto de moldes em vários tamanhos pode ser preparado. Este estudo utilizou S = 10 mm.
      NOTA: As equações são derivadas com base na geometria do esquema óptico e nas proporções corporais do peixe-zebra. Explicações detalhadas são fornecidas na seção Discussão.
   4. Escolha uma lente: Este estudo usou um sistema óptico com ampliações variáveis variando de M_OSmin = 0,4x a M_OSmax = 1,5x, uma distância focal máxima de f_max = 150 mm e uma distância de trabalho de mm.
      NOTA: O símbolo x indica o fator de ampliação do sistema óptico.
      1. Escolha um sistema do tipo microscópio de ampliação variável com uma faixa de ampliação (M_OSmin - M_OSmax) que permaneça dentro da faixa permitida (M_min - M_max). Consulte a folha de dados da lente para determinar a distância focal máxima f_max e a distância de trabalho correspondente L para M_OSmax.
      2. Certifique-se de que a condição f_max ≤ M_max • L seja satisfeita. Se esta condição não for atendida, selecione uma lente com um f_max e/ou L diferente. Certifique-se de que o tipo de montagem da câmera e da lente sejam compatíveis.
   5. Escolha um objeto de teste (uma régua ou uma grade) com um passo conhecido e um comprimento total de pelo menos . Escolha um objeto de teste na forma de uma régua ou grade com um passo conhecido e um tamanho total de pelo menos S_máx.
2. Montagem de um suporte para aquisição de imagens (Figura 1).
   1. Monte a haste redonda em uma base estável. Monte o sistema de imagem conectando a lente à câmera. Monte o canal de imagem na haste com a janela de entrada voltada para cima.
   2. Monte o mecanismo de foco na haste. Fixe uma platina com uma superfície de trabalho de vidro com um diâmetro mínimo de 30 mm ao mecanismo de foco.
   3. Monte o iluminador: Coloque o LED em um substrato de metal para garantir uma dissipação de calor eficiente. Coloque uma lente colimadora plana convexa com um diâmetro de 23 mm e uma distância focal de 30 mm a uma distância de 30 mm do LED.
   4. Monte o iluminador no palco usando um suporte ajustável de três eixos, posicionando-o acima da superfície de trabalho com a lente voltada para baixo.
   5. Ajuste o iluminador e o sistema de imagem. Posicione o iluminador coaxialmente com o sistema de imagem. Ligue o iluminador e conecte a câmera ao computador.
   6. Inicie o aplicativo da câmera e ative o modo de visualização seguindo as instruções no manual da câmera. Coloque o objeto de teste no palco. Ajuste a distância de trabalho e a ampliação do microscópio para garantir que o tamanho se encaixe completamente no campo de visão.
      NOTA: O tamanho deve caber inteiramente ao longo do lado curto da moldura para garantir a visualização completa do molde de agarose.
   7. Ajuste a posição da platina em relação ao sistema de imagem para garantir que a imagem esteja focada e a posição do iluminador seja iluminada uniformemente.
3. Preparação de molde de agarose
   1. Misture 20 mL de água destilada com 0,4 g de agarose de baixo ponto de fusão e aqueça a mistura até que a agarose se dissolva completamente. Por exemplo, em um microondas por 20 s a uma potência de 700 W.
   2. Molde o molde de agarose (Método 1): Despeje a solução aquecida na placa de Petri, garantindo uma altura de solução de 1,5-2 mm. Resfrie a placa de Petri até que a solução de agarose solidifique A uma temperatura de 17 °C, esse processo leva cerca de 5 min. Corte um quadrado com um comprimento lateral usando uma faca de papelaria e remova cuidadosamente a camada de agarose dentro da área delineada.
   3. Molde o molde de agarose (Método 2): Crie (S) × (S) × 10 mm, formas de plástico. Coloque a forma impressa com o lado quadrado em uma placa de Petri e encha-a com a solução aquecida, garantindo uma altura de solução de 1,5-2 mm. Resfrie a placa de Petri até que a solução de agarose solidifique e remova cuidadosamente a forma da solução solidificada.
      NOTA: Os formulários podem ser facilmente impressos usando uma impressora 3D.

2. Aquisição de imagem

1. Ajuste as configurações de captura de imagem.
   1. Conecte a câmera ao computador. Inicie o aplicativo da câmera e ative o modo de visualização. Ligue o iluminador.
      NOTA: Se o tamanho do molde de agarose a ser usado for diferente do da etapa 1.3.3, repita a etapa 1.3.3 e remova o objeto de teste do estágio depois disso.
   2. Coloque a larva do peixe-zebra em um molde de agarose por uma pipeta Pasteur. Coloque um molde de agarose no palco. Garanta a iluminação quase completa da cabeça da larva ajustando uma combinação de tempo de exposição e potência do iluminador (Figura 2A-C). O tempo de exposição não deve exceder 1,5 ms.
      NOTA: Neste estudo, apresentamos dados para larvas de peixe-zebra do tipo selvagem com idade entre 12 e 21 dias após a fertilização (dpf).
2. Realizar aquisição de imagem
   1. Defina a taxa de quadros para pelo menos 60 fps. Defina a profundidade de bits da imagem para 12 bits. Adquira imagens por pelo menos 10 seg. Defina o formato de nomenclatura do quadro como yyyy_mm_dd_hh_ss_mm_mss e o tipo de arquivo deve ser PNG ou TIFF, não BMP.

3. Treinando a rede neural para rotulagem

1. Preparação de dados para rotulagem
   NOTA: O processo de rotulagem no aplicativo Image Labeler, MATLAB, é descrito.
   1. Reúna pelo menos 256 imagens adquiridas em um diretório separado. Execute o aplicativo. Importe as imagens navegando até Importar > do arquivo De e selecionando todas as imagens do diretório especificado.
   2. Crie classes para rotulagem de rede. Na guia Rótulos de ROI, clique em Rótulo, insira corpo no campo Nome do rótulo , selecione Rótulo de pixel no menu suspenso para o tipo de rótulo e clique em OK. Na guia Rótulos de ROI, clique em Rótulo, digite olho no campo Nome do rótulo , selecione Rótulo de pixel no menu suspenso para o tipo de rótulo e clique em OK. Na guia Rótulos de ROI, clique em Rótulo, insira peixe no campo Nome do rótulo , selecione Retângulo no menu suspenso para o tipo de rótulo e clique em OK.
2. Etiquetagem dos quadros
   1. Na guia Rótulos de ROI, selecione a classe de anotação criada anteriormente, olho. Contorne um olho da amostra colocando pontos ao longo de seu perímetro usando o botão esquerdo do mouse. Para completar a anotação do olho, clique no ponto inicial do contorno (Figura 3B).
   2. Contorne outro olho da amostra da mesma maneira descrita na etapa 3.1.2.
   3. Na guia Rótulos de ROI, selecione a classe de anotação criada, body. Contorne o corpo do espécime, excluindo os olhos, colocando pontos ao longo de seu perímetro usando o botão esquerdo do mouse. Para completar a anotação do olho, clique no Ponto de Partida do Contorno.
   4. Na guia Rótulos de ROI, selecione a classe de anotação criada anteriormente, fish. Contorne todo o corpo da amostra desenhando uma caixa delimitadora retangular (Figura 4). Para fazer isso, clique em Um canto do retângulo pretendido com o botão esquerdo do mouse e arraste o cursor enquanto mantém o botão pressionado até que o retângulo envolva totalmente o peixe.
   5. Salve os contornos em um novo diretório chamado images clicando em Exportar > para arquivo na guia LABEL.
3. Preparando conjuntos de dados para treinamento de rede neural
   1. Inicie o MATLAB. Abra o arquivo de script DatasetsPreparation.m (Arquivo Suplementar 1) selecionando Abrir > Abrir.
   2. Execute o script clicando em Executar. Na janela pop-up, selecione o diretório que contém as imagens delineadas, a pasta PixelLabelData e o arquivo gTruth.mat, que foi exportado na etapa 3.2.5.
      NOTA: Após a conclusão da execução do script, duas pastas - RPN Training e CNN Training - serão geradas automaticamente. Eles são necessários para o treinamento subsequente da rede neural. Não modifique o conteúdo dessas pastas.

4. Treinando as redes neurais para detecção cardíaca

NOTA: Esta etapa é realizada uma vez para uma idade específica e condição de imagem. A GPU NVIDIA é fortemente recomendada para treinamento, pois acelera significativamente o processamento.

1. Inicie o aplicativo AutoHR. Navegue até a guia Treinamento de Rede de Proposta de Região. Clique em Escolher diretório e selecione a pasta RPN Training criada na etapa 3.3.2. Clique em Iniciar treinamento.
   NOTA: Após a conclusão da formação, será gerado um ficheiro de modelo denominado rpn_model.pt no mesmo diretório que o ficheiro AutoHR.exe. Este arquivo é necessário para processamento adicional da pilha de imagens.
2. Para treinar a Rede Neural Convolucional, navegue até a guia Treinamento de Rede Neural Convolucional. Clique em Escolher diretório e selecione a pasta CNN Training criada na etapa 3.3.2. Clique em Iniciar treinamento.
   NOTA: Após a conclusão do treinamento, um arquivo de modelo chamado model.pt será gerado no mesmo diretório que o arquivo AutoHR.exe. Este arquivo é necessário para processamento adicional da pilha de imagens.

5. Quantificação da frequência cardíaca

1. Grave uma sequência de imagens conforme descrito na etapa 2. Certifique-se de que as condições de imagem, como ampliação, tempo de exposição e iluminação, sejam idênticas às usadas para treinar a rede neural.
2. Inicie o aplicativo AutoHR. Navegue até a guia Processamento. Selecione o diretório que contém modelos de rede neural treinados clicando em Escolher modelos. Clique em Escolher pasta para importar as imagens adquiridas para análise. O caminho de exportação será especificado automaticamente, mas você pode alterá-lo clicando em Escolher caminho de exportação. Clique em Processar para iniciar a análise.
   NOTA: Após a conclusão, o valor da frequência cardíaca aparecerá no campo Frequência cardíaca na interface AutoHR. A pasta exportada incluirá os valores de frequência cardíaca (.xlsx), PPG (.xlsx), o primeiro quadro da sequência e as máscaras corporais e oculares do primeiro quadro (.png).

6. Verificação dos resultados do algoritmo

1. Efectuar o ensaio com um peixe imóvel conforme descrito a seguir.
   1. Anestesiar as larvas com solução de MS-222 0,168 mg/L por 1 min. Adquira uma pilha de imagens de uma amostra anestesiada, conforme descrito na etapa 2. Realize uma contagem da frequência cardíaca por meio da observação visual.
   2. Utilize o software de RH conforme descrito na etapa 5. Repita as etapas para várias amostras. Verifique se os valores de frequência cardíaca obtidos são consistentes para todos os indivíduos dentro da precisão desejada.
2. Realize o teste com um indivíduo móvel e teste de provocação, conforme descrito abaixo.
   1. Adquira uma pilha de imagens de uma amostra não anestesiada, conforme descrito na etapa 2. Realize um teste de provocação com o indivíduo para o qual a sequência foi gravada, usando um estímulo conhecido que afeta a frequência cardíaca. O estudo apresenta resultados para a salinização da água em concentrações de 5 mg/L.
   2. Adquira uma pilha de imagens da mesma amostra descrita na etapa 2 após o teste de provocação. Determine a frequência cardíaca em ambos os experimentos com o software de RH, conforme descrito na etapa 5. Verifique se as alterações observadas na frequência cardíaca estão alinhadas com os efeitos conhecidos do teste de provocação.

Resultados

A frequência cardíaca do peixe-zebra a 12 dpf foi determinada usando o protocolo descrito acima (Vídeo Suplementar 1). Os vídeos incluem uma sequência de imagens de larvas de peixe-zebra nadando livremente, um fotopletismograma derivado dessas sequências usando o protocolo proposto e a frequência cardíaca correspondente calculada a partir do fotopletismograma.

Os dados rotulados foram divididos aleatoriamente em conjuntos de treinament...

Discussão

Neste estudo, apresentamos um protocolo experimental para medir os batimentos cardíacos de larvas de peixe-zebra nadando livremente. Avaliamos essa abordagem por meio de vários experimentos, demonstrando sua eficácia. Os principais componentes do método proposto incluem soluções de hardware e software. Primeiramente, utilizamos iluminação infravermelha para a imagem, que, como demonstrado anteriormente, evita problemas relacionados à pigmentação e aumenta a transparência do t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Low melting agarose	Biozym	850111
Table salt	Pegasus	N/A
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10505	MS-222
Equipment
Base with rod	Altami	SM-U1
Collimator lens	JLLSCMGGX		Focal length 30 mm
Focusing mechanism	Altami	SM-12	D=76 mm
LED	Cree	TR-3535IR-3W
Lens	SFK Security		C-Mount, F1.6, 1/3”,
Near infrared camera	ToupTek	SWIR1300KMA
Pasteur pipette	PE-LD	149293
Petri Dish 35 x 15 mm	BD Falcon	351008
Plastic forms	N/A	N/A	Made by 3D printing
Power supply	Unit-T	UTP3300TFL-II
Stage	N/A	N/A	Made by 3D printing
Stationery knife	ErichKrause	19145
Test object	Wally Sky	MS-1-EB
Software
EfficientDet	N/A	N/A	https://github.com/rwightman/efficientdet-pytorch
EfficientNet-b0 model	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/1905.11946
Google API Client	Google	N/A	Google API Client is a Python client library for Google's discovery-based APIs. https://github.com/googleapis/google-api-python-client
Hardware
Multi-scale attention network	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/2209.14145
NVIDIA DIGITS	NVIDIA	N/A	NVIDIA DIGITS is a wrapper for Caffe that provides a graphical web interface. https://developer.nvidia.com/digits
NVIDIA GPU	NVIDIA	N/A	An NVIDIA GPU is needed as some of the software frameworks below will not work otherwise. https://www.nvidia.com
OpenCV	Intel	N/A	OpenCV is a library for computer vision. https://opencv.org
Python	Python Software Foundation	N/A	Python is a programming language. https://www.python.org