Misurazioni del battito cardiaco senza anestesia in zebrafish in movimento libero

Riepilogo

Lo studio mira a sviluppare una tecnologia per la misurazione del battito cardiaco senza anestesia nel pesce zebra in movimento. Il nostro approccio combina l'imaging a infrarossi a onde corte e il monitoraggio del cuore basato sull'apprendimento automatico. Si tratta di una tecnica non invasiva, priva di etichette e di facile utilizzo che si adatta a un'ampia gamma di studi sul modello di zebrafish.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è un organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca fisiologica, farmacologica e tossicologica grazie alla sua somiglianza genetica con l'uomo e allo stadio embrionale trasparente, che facilita gli studi cardiovascolari non invasivi. Tuttavia, gli attuali metodi per la valutazione della frequenza cardiaca nel pesce zebra spesso si basano sull'anestesia per immobilizzare il soggetto, introducendo alterazioni fisiologiche che compromettono l'accuratezza e la riproducibilità dei dati. Questo studio presenta una nuova tecnica senza anestesia per misurare il battito cardiaco nelle larve di zebrafish che si muovono liberamente, affrontando una limitazione critica nella ricerca cardiovascolare. L'approccio proposto integra l'imaging a infrarossi a onde corte con il tracciamento cardiaco basato sull'apprendimento automatico, consentendo un monitoraggio preciso e continuo dell'attività cardiaca in campioni non immobilizzati. Una rete neurale convoluzionale è stata addestrata per rilevare la regione cardiaca e un segnale fotopletismografico è stato estratto dalle sequenze di immagini per determinare la frequenza cardiaca. La convalida sperimentale ha dimostrato l'affidabilità e la coerenza del metodo in più condizioni di test. Un vantaggio chiave della metodologia è la sua capacità di preservare lo stato fisiologico naturale del pesce zebra, riducendo al minimo gli artefatti indotti dallo stress. Questa tecnica non invasiva e priva di marcatura offre vantaggi significativi per lo studio della fisiologia cardiovascolare, della cardiotossicità dei farmaci e della tossicologia ambientale, ampliando le potenziali applicazioni del pesce zebra come modello per la ricerca biomedica.

Introduzione

Il pesce zebra (Danio rerio), un piccolo pesce ciprinide, è diventato un organismo modello essenziale grazie alle sue piccole dimensioni, all'alto tasso di riproduzione e alla facilità di manipolazione genetica ^1,2,3. La valutazione della frequenza cardiaca negli embrioni trasparenti di zebrafish è sempre più utilizzata in fisiologia, embriologia, tossicologia e altri campi 4,5,6,7,8. Da un lato, questa utilità è dovuta al fatto che il genoma del pesce zebra include geni associati a malattie cardiovascolari umane⁹ e il cuore di Danio rerio condivide strutture e vie di segnalazione simili con gli esseri umani^10,11. Rende il pesce zebra un modello inestimabile per lo studio dello sviluppo e delle malattie cardiache 11,12,13. D'altra parte, la frequenza cardiaca del pesce zebra è sensibile alle influenze esterne, il che lo rende un modello eccellente per studi fisiologici e tossicologici confrontando la funzione cardiaca nei pesci trattati e non trattati ^7,8,14.

Sono stati compiuti progressi significativi nello sviluppo di metodi ottici non invasivi per la valutazione della frequenza cardiaca in embrioni di pesce trasparenti^15,16. Queste tecniche offrono il vantaggio di una rapida raccolta di dati da campioni di grandi dimensioni. Di conseguenza, sono stati sviluppati approcci completamente automatizzati per la valutazione della frequenza cardiaca negli embrioni di pesce 4,5,6,17.

Tuttavia, alcune limitazioni attualmente limitano l'uso di queste tecniche al periodo di 3-4 dpf. La prima limitazione è una perdita di trasparenza dovuta alla pigmentazione del corpo del pesce. Il secondo è l'aumento della mobilità degli embrioni nel tempo. Estendere il periodo di sviluppo precoce del pesce zebra durante il quale gli approcci ottici possono essere utilizzati migliorerebbe la loro utilità, consentendo disegni sperimentali a lungo termine per studiare la cardiomiopatia, i difetti cardiaci congeniti e vari impatti sul sistema cardiovascolare, compreso il monitoraggio della dinamica degli effetti nel tempo. Il nostro gruppo ha recentemente affrontato il problema della perdita di trasparenza impiegando l'imaging nella gamma dell'infrarosso a onde corte di 900-1700 nm¹⁸. Questo articolo si concentra sull'affrontare la questione della mobilità degli embrioni.

Tipicamente, anestetici come la tricaina metanassonato (MS-222) vengono utilizzati per immobilizzare embrioni e larve di pesci che nuotano liberamente prima dell'imaging 14,19,20. Tuttavia, MS-222 riduce significativamente la frequenza cardiaca^21,22, così come altri anestetici²³. Diventa difficile discernere se i cambiamenti osservati nella funzione cardiaca sono dovuti a un trattamento sperimentale, all'anestetico o a un'interazione tra i due. Un altro modo per prolungare il periodo di bassa mobilità dell'embrione è ridurre la temperatura durante lo sviluppo precoce⁸. Tuttavia, questo approccio non è sempre compatibile con gli obiettivi della ricerca e prolunga solo in minima parte il periodo di registrazione.

In questo studio, introduciamo un nuovo metodo per affrontare la mobilità dell'embrione durante la registrazione della frequenza cardiaca. Abbiamo addestrato una rete neurale convoluzionale per identificare la regione di interesse del cuore nelle registrazioni di embrioni di pesce zebra che nuotano liberamente. La variazione periodica dell'intensità dei pixel all'interno di quest'area viene utilizzata per derivare il fotopletismogramma (PPG), che viene successivamente utilizzato per calcolare la frequenza cardiaca. L'applicazione desktop sviluppata, AutoHR, ha utilizzato sia l'addestramento della rete neurale che l'elaborazione dello stack di immagini, garantendo facilità d'uso e riproducibilità del protocollo.

Protocollo

I pesci zebra sono stati allevati e allevati secondo i protocolli ZFIN²⁴ stabiliti. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato di Bioetica del Centro Scientifico e Tecnologico di Strumentazione Unica dell'Accademia Russa delle Scienze (STC UI RAS), protocollo #3/24, datato 08/21/2024, e seguono le linee guida per la cura del pesce zebra di STC UI RAS. Su richiesta sono disponibili manuali per le singole versioni.

1. Preparazione dell'attrezzatura per la misurazione

1. Selezione dell'attrezzatura
   1. Scegli una sorgente luminosa: scegli una sorgente luminosa a LED che emetta nella gamma del vicino infrarosso, in particolare da 800 nm, con una potenza minima di uscita di 3 W. Questo studio ha utilizzato LED con una lunghezza d'onda centrale di 940 nm e una larghezza di banda di 40 nm.
   2. Scegli una videocamera: scegli una fotocamera dotata di un sensore sensibile alla gamma di lunghezze d'onda emesse dalla sorgente luminosa e con un frame rate di almeno 60 fps. Fare riferimento alla scheda tecnica della fotocamera per determinare il pixel pitch p, la dimensione del sensore lungo il lato più corto h e la frequenza dei fotogrammi. In questo studio, la fotocamera ha un passo dei pixel di p = 5 μm e una larghezza del sensore h = 5,12 mm.
   3. Scegli una dimensione dello stampo di agarosio che sia almeno 1,5 volte maggiore della lunghezza della larva B. Calcolare gli ingrandimenti minimi e massimi consentiti del sistema ottico utilizzando le espressioni fornite. Assicurarsi che M_max ≤ M_min. Se questa condizione non è soddisfatta, selezionare una telecamera con una h più grande e/o una S più piccola e/o più piccola.
      
      
      dove S_max è la lunghezza dello stampo di agarosio più grande del set di stampi. È possibile preparare una serie di stampi di varie dimensioni. Questo studio ha utilizzato S = 10 mm.
      NOTA: Le equazioni sono derivate in base alla geometria dello schema ottico e alle proporzioni del corpo del pesce zebra. Spiegazioni dettagliate sono fornite nella sezione Discussione.
   4. Scegli un obiettivo: questo studio ha utilizzato un sistema ottico con ingrandimenti variabili che vanno da M_OSmin = 0,4x a M_OSmax = 1,5x, una lunghezza focale massima di f_max = 150 mm e una distanza di lavoro di mm.
      NOTA: Il simbolo x indica il fattore di ingrandimento del sistema ottico.
      1. Scegliere un sistema di microscopio a ingrandimento variabile con un intervallo di ingrandimento (M_OSmin - M_OSmax) che rimane all'interno dell'intervallo consentito (M_min - M_max). Fare riferimento alla scheda tecnica dell'obiettivo per determinare la lunghezza focale massima f_max e la corrispondente distanza di lavoro L per M_OSmax.
      2. Assicurarsi che la condizione f_max ≤ M_max • L sia soddisfatta. Se questa condizione non viene soddisfatta, selezionare un obiettivo con un f_max e/o L diverso. Assicurarsi che il tipo di innesto della fotocamera e dell'obiettivo siano compatibili.
   5. Scegli un oggetto di prova (un righello o una griglia) con un passo noto e una lunghezza totale di almeno . Scegli un oggetto di prova sotto forma di righello o griglia con un passo noto e una dimensione totale di almeno S_max.
2. Montaggio di un supporto per l'acquisizione delle immagini (Figura 1).
   1. Montare l'asta tonda su una base stabile. Assemblare il sistema di imaging collegando l'obiettivo alla fotocamera. Montare il canale di imaging sull'asta con la finestra di ingresso rivolta verso l'alto.
   2. Montare il meccanismo di messa a fuoco sull'asta. Fissare un tavolino con una superficie di lavoro in vetro con un diametro minimo di 30 mm al meccanismo di messa a fuoco.
   3. Assemblare l'illuminatore: posizionare il LED su un substrato metallico per garantire un'efficiente dissipazione del calore. Posizionare una lente di collimatore piatta convessa con un diametro di 23 mm e una lunghezza focale di 30 mm a una distanza di 30 mm dal LED.
   4. Montare l'illuminatore sul tavolino utilizzando una staffa regolabile su tre assi, posizionandolo sopra il piano di lavoro con la lente rivolta verso il basso.
   5. Regolare l'illuminatore e il sistema di imaging. Posizionare l'illuminatore coassialmente con il sistema di imaging. Accendere l'illuminatore e collegare la fotocamera al computer.
   6. Avvia l'applicazione della fotocamera e attiva la modalità di anteprima seguendo le istruzioni nel manuale della fotocamera. Posiziona l'oggetto di test sullo stage. Regolare la distanza di lavoro e l'ingrandimento del microscopio per assicurarsi che le dimensioni si adattino completamente al campo visivo.
      NOTA: La dimensione deve adattarsi interamente al lato corto del telaio per garantire una visualizzazione completa dello stampo di agarosio.
   7. Regolare la posizione del tavolino rispetto al sistema di imaging per garantire che l'immagine sia a fuoco e che la posizione dell'illuminatore sia illuminata in modo uniforme.
3. Preparazione dello stampo di agarosio
   1. Mescolare 20 ml di acqua distillata con 0,4 g di agarosio a basso punto di fusione e scaldare la miscela fino a quando l'agarosio non si scioglie completamente. Ad esempio, in un forno a microonde per 20 s a una potenza di 700 W.
   2. Modellare lo stampo di agarosio (Metodo 1): Versare la soluzione riscaldata nella capsula di Petri, assicurandosi di un'altezza della soluzione di 1,5-2 mm. Raffreddare la capsula di Petri fino a quando la soluzione di agarosio non si sarà solidificata. A una temperatura di 17 °C, questo processo dura circa 5 minuti. Taglia un quadrato con una lunghezza laterale usando un coltello da cancelleria e rimuovi con cura lo strato di agarosio all'interno dell'area delineata.
   3. Modellare lo stampo di agarosio (Metodo 2): creare (S) × (S) × 10 mm, forme da plastica. Posizionare il modulo stampato con il lato quadrato in una capsula di Petri e riempirlo con la soluzione riscaldata, garantendo un'altezza della soluzione di 1,5-2 mm. Raffreddare la capsula di Petri fino a quando la soluzione di agarosio non si è solidificata e rimuovere con cura la forma dalla soluzione solidificata.
      NOTA: I moduli possono essere facilmente stampati utilizzando una stampante 3D.

2. Acquisizione delle immagini

1. Regolare le impostazioni di acquisizione delle immagini.
   1. Collegare la fotocamera al computer. Avvia l'applicazione della fotocamera e abilita la modalità di anteprima. Accendi l'illuminatore.
      NOTA: Se la dimensione dello stampo di agarosio da utilizzare differisce da quella del passaggio 1.3.3, ripetere il passaggio 1.3.3 e rimuovere l'oggetto di prova dal tavolino successivo.
   2. Mettere la larva di pesce zebra in uno stampo di agarosio con una pipetta Pasteur. Posizionare uno stampo di agarosio sul palco. Garantire un'illuminazione quasi completa della testa della larva regolando una combinazione di tempo di esposizione e potenza dell'illuminatore (Figura 2A-C). Il tempo di esposizione non deve superare 1,5 ms.
      NOTA: In questo studio, presentiamo i dati per le larve di pesce zebra wild-type di età compresa tra 12 e 21 giorni dopo la fecondazione (dpf).
2. Eseguire l'acquisizione delle immagini
   1. Imposta la frequenza dei fotogrammi su almeno 60 fps. Impostare la profondità di bit dell'immagine su 12 bit. Acquisire immagini per almeno 10 s. Impostate il formato di denominazione dei fotogrammi su yyyy_mm_dd_hh_ss_mm_mss e il tipo di file deve essere PNG o TIFF, non BMP.

3. Addestramento della rete neurale per l'etichettatura

1. Preparazione dei dati per l'etichettatura
   NOTA: Viene descritto il processo di etichettatura nell'app Image Labeler, MATLAB.
   1. Raccogli almeno 256 immagini acquisite in una directory separata. Esegui l'app. Importa le immagini accedendo a Importa > da file e selezionando tutte le immagini dalla directory specificata.
   2. Creare classi per l'etichettatura di rete. Nella scheda Etichette ROI, fai clic su Etichetta, inserisci il corpo nel campo Nome etichetta , seleziona Etichetta pixel dal menu a discesa per il tipo di etichetta e fai clic su OK. Nella scheda Etichette ROI, fai clic su Etichetta, inserisci l'occhio nel campo Nome etichetta , seleziona Etichetta pixel dal menu a discesa per il tipo di etichetta e fai clic su OK. Nella scheda Etichette ROI, fai clic su Etichetta, inserisci fish nel campo Nome etichetta , seleziona Rettangolo dal menu a discesa per il tipo di etichetta e fai clic su OK.
2. Etichettatura dei telai
   1. Nella scheda Etichette ROI, selezionare la classe di annotazione creata in precedenza, eye. Delinea un occhio del campione posizionando i punti lungo il suo perimetro usando il tasto sinistro del mouse. Per completare l'annotazione dell'occhio, fare clic sul punto iniziale del contorno (Figura 3B).
   2. Delineare un altro occhio del campione nello stesso modo descritto al punto 3.1.2.
   3. Nella scheda Etichette ROI, selezionare la classe di annotazione creata, il corpo. Delineare il corpo del campione, esclusi gli occhi, posizionando dei punti lungo il suo perimetro utilizzando il tasto sinistro del mouse. Per completare l'annotazione dell'occhio, fare clic sul punto iniziale del contorno.
   4. Nella scheda Etichette ROI, selezionare la classe di annotazione creata in precedenza, fish. Delineare l'intero corpo del campione disegnando un riquadro di delimitazione rettangolare (Figura 4). Per fare ciò, fare clic su un angolo del rettangolo desiderato con il tasto sinistro del mouse, quindi trascinare il cursore tenendo premuto il pulsante fino a quando il rettangolo non racchiude completamente il pesce.
   5. Salvare i contorni in una nuova directory denominata images facendo clic su Esporta > su file nella scheda ETICHETTA.
3. Preparazione dei set di dati per l'addestramento delle reti neurali
   1. Avviare MATLAB. Aprire il file di script DatasetsPreparation.m (File supplementare 1) selezionando Apri > Apri.
   2. Eseguire lo script facendo clic su Esegui. Nella finestra pop-up, selezionare la directory contenente le immagini delineate, la cartella PixelLabelData e il file gTruth.mat, esportato nel passaggio 3.2.5.
      NOTA: Al termine dell'esecuzione dello script, verranno generate automaticamente due cartelle: RPN Training e CNN Training. Sono necessari per il successivo addestramento della rete neurale. Non modificare il contenuto di queste cartelle.

4. Addestrare le reti neurali per il rilevamento del cuore

NOTA: Questo passaggio viene eseguito una volta per un'età e una condizione di imaging specifiche. La GPU NVIDIA è fortemente consigliata per l'addestramento in quanto accelera significativamente l'elaborazione.

1. Avvia l'applicazione AutoHR. Vai alla scheda Formazione della rete di proposte regionali. Fare clic su Scegli directory e selezionare la cartella di formazione RPN creata nel passaggio 3.3.2. Fare clic su Inizia formazione.
   NOTA: Al termine del training, verrà generato un file di modello denominato rpn_model.pt nella stessa directory del file AutoHR.exe. Questo file è necessario per l'ulteriore elaborazione dello stack di immagini.
2. Per addestrare la rete neurale convoluzionale, accedere alla scheda Addestramento rete neurale convoluzionale. Fare clic su Scegli directory e selezionare la cartella CNN Training creata nel passaggio 3.3.2. Fare clic su Inizia formazione.
   NOTA: Al termine del training, verrà generato un file di modello denominato model.pt nella stessa directory del file AutoHR.exe. Questo file è necessario per l'ulteriore elaborazione dello stack di immagini.

5. Quantificazione della frequenza cardiaca

1. Registrare una sequenza di immagini come descritto al punto 2. Assicurarsi che le condizioni di imaging, come l'ingrandimento, il tempo di esposizione e l'illuminazione, siano identiche a quelle utilizzate per l'addestramento della rete neurale.
2. Avvia l'applicazione AutoHR. Passare alla scheda Elaborazione. Selezionare la directory contenente i modelli di rete neurale addestrati facendo clic su Scegli modelli. Fare clic su Scegli cartella per importare le immagini acquisite per l'analisi. Il percorso di esportazione verrà specificato automaticamente, ma è possibile modificarlo facendo clic su Scegli percorso di esportazione. Fare clic su Elabora per avviare l'analisi.
   NOTA: Al termine, il valore della frequenza cardiaca apparirà nel campo Frequenza cardiaca all'interno dell'interfaccia AutoHR. La cartella esportata includerà i valori della frequenza cardiaca (.xlsx), PPG (.xlsx), il primo fotogramma della sequenza e le maschere del corpo e degli occhi per il primo fotogramma (.png).

6. Verifica dei risultati dell'algoritmo

1. Eseguire il test con un pesce immobile come descritto di seguito.
   1. Anestetizzare le larve con una soluzione di MS-222 0,168 mg/L per 1 minuto. Acquisire una pila di immagini di un campione anestetizzato come descritto nel passaggio 2. Eseguire un conteggio della frequenza cardiaca attraverso l'osservazione visiva.
   2. Utilizza il software HR come descritto nel passaggio 5. Ripetere i passaggi per diversi campioni. Verificare se i valori della frequenza cardiaca ottenuti sono coerenti per tutti gli individui entro la precisione desiderata.
2. Eseguire il test con un individuo mobile e il test di provocazione come descritto di seguito.
   1. Acquisire una pila di immagini di un campione non anestetizzato come descritto nel passaggio 2. Condurre un test di provocazione con l'individuo per il quale è stata registrata la sequenza, utilizzando uno stimolo noto che influisce sulla frequenza cardiaca. Lo studio presenta i risultati della salinizzazione dell'acqua a concentrazioni di 5 mg/L.
   2. Acquisire una pila di immagini dello stesso campione come descritto nel passaggio 2 dopo il test di provocazione. Determinare la frequenza cardiaca in entrambi gli esperimenti con il software HR come descritto al punto 5. Verificare se le variazioni osservate nella frequenza cardiaca sono in linea con gli effetti noti del test di provocazione.

Risultati

La frequenza cardiaca del pesce zebra a 12 dpf è stata determinata utilizzando il protocollo sopra descritto (Video supplementare 1). I video includono una sequenza di immagini di larve di pesce zebra che nuotano liberamente, un fotopletismogramma derivato da queste sequenze utilizzando il protocollo proposto e la frequenza cardiaca corrispondente calcolata dal fotopletismogramma.

I dati etichettati sono stati suddivisi in modo casuale in set...

Discussione

In questo studio, presentiamo un protocollo sperimentale per misurare il battito cardiaco delle larve di pesce zebra che nuotano liberamente. Abbiamo valutato questo approccio attraverso diversi esperimenti, dimostrandone l'efficacia. I componenti chiave del metodo proposto includono sia soluzioni hardware che software. In primo luogo, abbiamo utilizzato l'illuminazione a infrarossi per l'imaging che, come dimostrato in precedenza, evita problemi legati alla pigmentazione e migliora la t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Low melting agarose	Biozym	850111
Table salt	Pegasus	N/A
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10505	MS-222
Equipment
Base with rod	Altami	SM-U1
Collimator lens	JLLSCMGGX		Focal length 30 mm
Focusing mechanism	Altami	SM-12	D=76 mm
LED	Cree	TR-3535IR-3W
Lens	SFK Security		C-Mount, F1.6, 1/3”,
Near infrared camera	ToupTek	SWIR1300KMA
Pasteur pipette	PE-LD	149293
Petri Dish 35 x 15 mm	BD Falcon	351008
Plastic forms	N/A	N/A	Made by 3D printing
Power supply	Unit-T	UTP3300TFL-II
Stage	N/A	N/A	Made by 3D printing
Stationery knife	ErichKrause	19145
Test object	Wally Sky	MS-1-EB
Software
EfficientDet	N/A	N/A	https://github.com/rwightman/efficientdet-pytorch
EfficientNet-b0 model	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/1905.11946
Google API Client	Google	N/A	Google API Client is a Python client library for Google's discovery-based APIs. https://github.com/googleapis/google-api-python-client
Hardware
Multi-scale attention network	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/2209.14145
NVIDIA DIGITS	NVIDIA	N/A	NVIDIA DIGITS is a wrapper for Caffe that provides a graphical web interface. https://developer.nvidia.com/digits
NVIDIA GPU	NVIDIA	N/A	An NVIDIA GPU is needed as some of the software frameworks below will not work otherwise. https://www.nvidia.com
OpenCV	Intel	N/A	OpenCV is a library for computer vision. https://opencv.org
Python	Python Software Foundation	N/A	Python is a programming language. https://www.python.org