자유롭게 움직이는 제브라피시의 마취 없는 심장 박동 측정

요약

이 연구는 움직이는 제브라피시에서 마취 없는 심장 박동 측정을 위한 기술을 개발하는 것을 목표로 합니다. 우리의 접근 방식은 단파 적외선 이미징과 기계 학습 기반 심장 추적을 결합합니다. 이는 비침습적이고 라벨이 없으며 사용자 친화적인 기술로, 제브라피시 모델에 대한 광범위한 연구에 적합합니다.

초록

제브라피시(Danio rerio)는 인간과 유전적 유사성과 투명한 배아 단계로 인해 생리학, 약리학 및 독성학 연구에서 널리 사용되는 모델 유기체로 비침습적 심혈관 연구를 용이하게 합니다. 그러나 현재 제브라피시의 심박수 평가 방법은 피험자를 움직이지 못하게 하기 위해 마취에 의존하는 경우가 많아 데이터 정확성과 재현성을 손상시키는 생리학적 변화가 발생합니다. 이 연구는 자유롭게 움직이는 제브라피시 유충의 심장 박동을 측정하기 위한 새로운 무마취 기술을 제시하여 심혈관 연구의 중요한 한계를 해결합니다. 제안된 접근 방식은 단파 적외선 이미징과 머신 러닝 기반 심장 추적을 통합하여 고정되지 않은 표본에서 정확하고 지속적인 심장 활동 모니터링을 가능하게 합니다. 심장 영역을 감지하기 위해 컨볼루션 신경망을 훈련시켰고, 심박수를 결정하기 위해 이미지 시퀀스에서 광혈류 신호를 추출했습니다. 실험적 검증은 여러 테스트 조건에서 방법의 신뢰성과 일관성을 입증했습니다. 이 방법론의 주요 이점은 제브라피시의 자연스러운 생리적 상태를 보존하여 스트레스로 인한 인공물을 최소화할 수 있다는 것입니다. 이 비침습적이고 라벨이 없는 기술은 심혈관 생리학, 약물 심장 독성 및 환경 독성학 연구에 상당한 이점을 제공하여 생물 의학 연구의 모델로서 제브라피시의 잠재적 응용 분야를 확장합니다.

서문

작은 사이프리니드 물고기인 제브라피시(Danio rerio)는 작은 크기, 높은 번식률, 유전자 조작의 용이성으로 인해 필수 모델 유기체가 되었습니다 ^1,2,3. 투명 제브라피시 배아의 심박수 평가는 생리학, 발생학, 독성학 및 기타 분야에서 점점 더 많이 활용되고 있습니다 ^4,5,6,7,8. 한편으로는, 제브라피시 게놈(genome)이 인간의 심혈관 질환과 관련된 유전자를 포함하고^있으며9, 다니오 레리오 심장(Danio rerio heart)이 인간과 유사한 구조와 신호 경로를 공유한다는 사실에 기인합니다^10,11. 이는 제브라피시를 심장 발달 및 질병 연구를 위한 귀중한 모델로 만듭니다 11,12,13. 반면에, 제브라피시 심박수는 외부 영향에 민감하기 때문에 처리된 물고기와 치료되지 않은 물고기의 심장 기능을 비교함으로써 생리학 및 독성학 연구를 위한 훌륭한 모델입니다 ^7,8,14.

투명한 어류 배아에서 심박수를 평가하기 위한 비침습적 광학 방법을 개발하는 데 상당한 진전이 이루어졌습니다^15,16. 이러한 기법은 큰 표본 크기에서 데이터를 빠르게 수집할 수 있는 이점을 제공합니다. 그 결과, 어류 배아의 심박수 평가를 위한 완전 자동화된 접근법이 개발되었습니다 ^4,5,6,17.

그러나 현재 이러한 기술의 사용을 3-4 dpf 기간으로 제한하는 특정 제한 사항이 있습니다. 첫 번째 한계는 물고기 몸체의 색소 침착으로 인한 투명도 손실입니다. 두 번째는 시간이 지남에 따라 배아의 이동성이 증가한다는 것입니다. 광학 접근 방식을 사용할 수 있는 제브라피쉬의 초기 개발 기간을 연장하면 유용성이 향상되어 장기 실험 설계에서 심근병증, 선천성 심장 결함 및 시간 경과에 따른 영향의 역학 추적을 포함하여 심혈관계에 대한 다양한 영향을 연구할 수 있습니다. 우리 그룹은 최근 900-1700 nm의 단파 적외선 범위에서 이미징을 사용하여 투명도 손실 문제를 해결했습니다¹⁸. 이 논문은 배아 이동성 문제를 해결하는 데 중점을 둡니다.

일반적으로 트리카인 메탄설포네이트(MS-222)와 같은 마취제는 이미징 전에 자유롭게 수영하는 물고기 배아와 유충을 고정시키는 데 사용됩니다 14,19,20. 그러나 MS-222는 다른 마취제와 마찬가지로 심박수를 현저히 감소시킵니다^21,22 . 관찰된 심장 기능의 변화가 실험적 치료에 의한 것인지, 마취제 때문인지, 아니면 둘 사이의 상호 작용에 의한 것인지 구분하기가 어려워집니다. 배아의 낮은 이동성 기간을 연장하는 또 다른 방법은 초기 발달 기간 동안 온도를 낮추는 것입니다⁸. 그러나 이 접근 방식은 연구 목표와 항상 양립할 수 있는 것은 아니며 등록 기간을 최소한으로 연장할 뿐입니다.

이 연구에서는 심박수 등록 중 배아 이동성을 해결하는 새로운 방법을 소개합니다. 우리는 자유롭게 헤엄치는 제브라피시 배아의 기록에서 심장의 관심 영역을 식별하기 위해 컨볼루션 신경망을 훈련시켰습니다. 이 영역 내에서 픽셀 강도의 주기적 변화는 광용적맥파(PPG)를 도출하는 데 사용되며, 이는 이후에 심박수를 계산하는 데 사용됩니다. 개발된 데스크톱 애플리케이션인 AutoHR은 신경망 교육과 이미지 스택 처리를 모두 활용하여 사용 편의성과 프로토콜 재현성을 보장했습니다.

프로토콜

제브라피쉬는 확립된 ZFIN 프로토콜²⁴에 따라 사육되고 길러졌습니다. 모든 절차는 2024년 8월 21일자 러시아 과학 아카데미(STC UI RAS)의 고유 계측 과학 기술 센터(STC UI RAS)의 생명윤리 위원회(Bioethics Committee)의 승인을 받았으며 STC UI RAS의 제브라피시 관리 지침을 따릅니다. 개별 버전에 대한 설명서는 요청 시 제공됩니다.

1. 측정을 위한 장비 준비

1. 장비 선택
   1. 광원 선택: 근적외선 범위, 특히 800nm에서 방출되는 LED 광원을 선택하고 최소 전력 출력은 3W입니다. 이 연구에서는 중심 파장이 940nm이고 대역폭이 40nm인 LED를 사용했습니다.
   2. 비디오 카메라 선택: 광원에서 방출되는 파장 범위에 민감한 센서가 장착되어 있고 프레임 속도가 60fps 이상인 카메라를 선택하십시오. 카메라의 데이터시트를 참조하여 픽셀 피치 p, 짧은 면 h를 따른 센서 크기 및 프레임 속도를 확인하십시오. 이 연구에서 카메라의 픽셀 피치는 p = 5μm이고 센서 너비는 h = 5.12mm입니다.
   3. 유충 B의 길이보다 최소 1.5배 큰 아가로스 곰팡이 크기를 선택하십시오. 제공된 표현식을 사용하여 광학 시스템의 최소 및 최대 허용 배율을 계산합니다. M_최대 ≤ _{M 최소}인지 확인하십시오. 이 조건이 충족되지 않으면 h가 더 크거나 S가 더 작거나 작은 카메라를 선택하십시오.
      
      
      여기서 S_max 는 금형 세트의 가장 큰 아가로스 금형의 길이입니다. 다양한 크기의 금형 세트를 준비 할 수 있습니다. 이 연구에서는 S = 10mm를 사용했습니다.
      참고: 방정식은 광학 구성표 형상과 제브라피쉬의 신체 비율을 기반으로 파생됩니다. 자세한 설명은 토론 섹션에서 확인할 수 있습니다.
   4. 렌즈 선택: 이 연구는 M_OSmin = 0.4x에서 M_OSmax = 1.5x 범위의 다양한 배율, f_max = 150mm의 최대 초점 거리 및 mm 작동 거리를 가진 광학 시스템을 사용했습니다.
      참고: 기호 x는 광학 시스템의 배율을 나타냅니다.
      1. 허용 범위(M_min - M max) 내에서 유지되는 배율 범위(M_OSmin - M_OSmax)를 가진 가변 배율 현미경 유형 시스템을 선택하십시오. 렌즈 데이터시트를 참조하여 M_OSmax에 대한 최대 초점 거리 f_max와 해당 working distance L을 확인하십시오.
      2. 조건 f_max ≤ M_max • L이 충족되는지 확인합니다. 이 조건이 충족되지 않으면 f_max 및/또는 L이 다른 렌즈를 선택하십시오. 카메라와 렌즈의 마운트 유형이 호환되는지 확인하십시오.
   5. 알려진 피치와 총 길이가 최소 인 테스트 개체(눈금자 또는 그리드)를 선택합니다. 알려진 피치와 _{총 크기가 최대} S 이상인 눈금자 또는 그리드 형태의 테스트 개체를 선택합니다.
2. 이미지 획득을 위한 스탠드 조립(그림 1).
   1. 안정된 바닥에 둥근 막대를 장착합니다. 렌즈를 카메라에 부착하여 이미징 시스템을 조립합니다. 입력 창이 위쪽을 향하도록 하여 로드에 이미징 채널을 장착합니다.
   2. 포커싱 메커니즘을 로드에 장착합니다. 최소 직경 30mm의 유리 작업 표면이 있는 스테이지를 포커싱 메커니즘에 부착합니다.
   3. 조명기 조립: 효율적인 방열을 보장하기 위해 금속 기판에 LED를 놓습니다. 직경이 23mm이고 초점 거리가 30mm인 볼록 평면 콜리메이터 렌즈를 LED에서 30mm 거리에 배치합니다.
   4. 3축 조정 가능한 브래킷을 사용하여 조명기를 s에 장착하고 렌즈가 아래를 향하도록 하여 작업 표면 위에 배치합니다.
   5. 조명기와 이미징 시스템을 조정합니다. 조명기를 이미징 시스템과 동축으로 배치합니다. 조명을 켜고 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
   6. 카메라 응용 프로그램을 실행하고 사전을 활성화합니다.view 카메라 설명서의 지침에 따라 모드를 사용합니다. 테스트 개체를 스테이지에 놓습니다. 현미경의 작동 거리와 배율을 조정하여 크기가 시야에 완전히 맞도록 합니다.
      참고: 크기는 아가로스 몰드의 완전한 시각화를 보장하기 위해 프레임의 짧은 면을 따라 완전히 맞아야 합니다.
   7. 이미징 시스템을 기준으로 스테이지의 위치를 조정하여 이미지의 초점이 맞춰지고 조명기의 위치가 균일하게 조명되도록 합니다.
3. 아가로스 곰팡이의 준비
   1. 증류수 20mL와 저융점 아가로스 0.4g을 섞어 아가로스가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 가열합니다. 예를 들어, 전자 레인지에서 20W의 전력으로 700 초 동안.
   2. 아가로스 몰드 모양(방법 1): 가열된 용액을 페트리 접시에 붓고 용액 높이가 1.5-2mm가 되도록 합니다. 아가로스 용액이 굳을 때까지 페트리 접시를 식힙니다. 17°C의 온도에서 이 과정은 약 5분이 소요됩니다. 문구용 칼을 사용하여 한 변의 길이로 사각형을 자르고 윤곽이 그려진 영역 내의 아가로스 층을 조심스럽게 제거합니다.
   3. 아가로스 몰드 형성(방법 2): 플라스틱으로 (S) × (S) × 10mm 형태를 만듭니다. 정사각형 면이 있는 인쇄된 양식을 페트리 접시에 놓고 가열된 용액으로 채워 용액 높이가 1.5-2mm가 되도록 합니다. 아가로스 용액이 응고될 때까지 페트리 접시를 식히고 응고된 용액에서 형태를 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 양식은 3D 프린터를 사용하여 쉽게 인쇄할 수 있습니다.

2. 이미지 획득

1. 이미지 캡처 설정을 조정합니다.
   1. 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 카메라 응용 프로그램을 실행하고 사전을 활성화합니다.view 모드. 조명기를 켭니다.
      참고: 사용할 아가로스 몰드의 크기가 1.3.3 단계와 다른 경우 1.3.3 단계를 반복하고 그 후 단계에서 테스트 개체를 제거합니다.
   2. 제브라 피쉬 유충을 파스퇴르 피펫으로 아가로스 틀에 넣습니다. 무대에 아가로스 몰드를 놓습니다. 노출 시간과 조명기 전력의 조합을 조정하여 유충 머리의 거의 완전한 조명을 보장합니다(그림 2A-C). 노출 시간은 1.5ms를 초과해서는 안 됩니다.
      참고: 이 연구에서는 수정 후 12일에서 21일(dpf)까지 생후 12일에서 21일 사이의 야생형 제브라피시 유충에 대한 데이터를 제시합니다.
2. 이미지 획득 수행
   1. 프레임 속도를 60fps 이상으로 설정합니다. 이미지 비트 심도를 12비트로 설정합니다. 최소 10초 동안 이미지를 획득합니다. 프레임 명명 형식을 yyyy_mm_dd_hh_ss_mm_mss로 설정하고 파일 형식은 BMP가 아닌 PNG 또는 TIFF여야 합니다.

3. 라벨링을 위한 신경망 훈련

1. 라벨링을 위한 데이터 준비
   참고: Image Labeler 앱 MATLAB에서 라벨링하는 과정에 대해 설명합니다.
   1. 별도의 디렉터리에 256개 이상의 획득한 이미지를 수집합니다. 앱을 실행합니다. Import > From file(파일에서 가져오기 )로 이동하고 지정된 디렉터리에서 모든 이미지를 선택하여 이미지를 가져옵니다.
   2. 네트워크 레이블 지정을 위한 클래스를 만듭니다. ROI Labels 탭에서 Label을 클릭하고, Label Name 필드에 body를 입력하고, 라벨 유형에 대한 드롭다운 메뉴에서 Pixel Label 을 선택하고, OK를 클릭합니다. ROI Labels 탭에서 Label을 클릭하고, Label Name 필드에 eye를 입력하고, 레이블 유형에 대한 드롭다운 메뉴에서 Pixel Label 을 선택하고, OK를 클릭합니다. ROI Labels 탭에서 Label을 클릭하고, Label Name 필드에 fish를 입력하고, 레이블 유형에 대한 드롭다운 메뉴에서 Rectangle 을 선택하고, OK를 클릭합니다.
2. 프레임의 라벨링
   1. ROI Labels 탭에서 이전에 생성한 주석 클래스 eye를 선택합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 표본의 둘레를 따라 점을 배치하여 표본의 한쪽 눈의 윤곽을 그립니다. 눈의 주석을 완성하려면 윤곽선의 시작점을 클릭하십시오(그림 3B).
   2. 3.1.2단계에서 설명한 것과 같은 방식으로 표본의 다른 눈의 윤곽을 그립니다.
   3. ROI Labels 탭에서 생성된 주석 클래스 body를 선택합니다. 눈을 제외한 표본의 몸체의 윤곽을 잡고, 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 표본의 둘레를 따라 점을 배치합니다. 눈의 주석을 완성하려면 윤곽선의 시작점을 클릭하십시오.
   4. ROI 레이블 탭에서 이전에 생성된 주석 클래스 fish를 선택합니다. 직사각형 경계 상자를 그려 표본의 전체 몸체를 윤곽을 그립니다(그림 4). 이렇게 하려면 마우스 왼쪽 버튼으로 원하는 사각형의 One Corner 를 클릭한 다음 사각형이 물고기를 완전히 둘러쌀 때까지 버튼을 누른 상태에서 커서를 드래그합니다.
   5. LABEL 탭에서 Export > To File 을 클릭하여 images라는 새 디렉토리에 개요를 저장합니다.
3. 신경망 훈련을 위한 데이터셋 준비하기
   1. MATLAB을 실행합니다. 열기(Open) > 열기(Open)를 선택하여 스크립트 파일 DatasetsPreparation.m(Supplementary File 1)을 엽니다.
   2. 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다. 팝업 창에서 윤곽선이 설정된 이미지가 포함된 디렉터리, 폴더 PixelLabelData, 3.2.5단계에서 내보낸 gTruth.mat 파일을 선택합니다.
      참고: 스크립트 실행이 완료되면 RPN Training과 CNN Training이라는 두 개의 폴더가 자동으로 생성됩니다. 후속 신경망 학습에 필요합니다. 이러한 폴더의 내용을 수정하지 마십시오.

4. 심장 감지를 위한 신경망 훈련

참고: 이 단계는 특정 연령 및 이미징 상태에 대해 한 번 수행됩니다. NVIDIA GPU는 처리 속도를 크게 높이므로 교육에 강력히 권장됩니다.

1. AutoHR 애플리케이션을 실행합니다. Region Proposal Network Training(지역 제안 네트워크 교육) 탭으로 이동합니다. 디렉토리 선택을 클릭하고 3.3.2단계에서 생성한 RPN 교육 폴더를 선택합니다. Start Training(교육 시작)을 클릭합니다.
   참고: 학습이 완료되면 AutoHR.exe 파일과 동일한 디렉터리에 rpn_model.pt라는 모델 파일이 생성됩니다. 이 파일은 추가 이미지 스택 처리에 필요합니다.
2. Convolutional Neural Network를 훈련시키려면 Convolutional Neural Network Training 탭으로 이동합니다. 디렉터리 선택을 클릭하고 3.3.2단계에서 만든 CNN 교육 폴더를 선택합니다. Start Training(교육 시작)을 클릭합니다.
   참고: 학습이 완료되면 AutoHR.exe 파일과 동일한 디렉터리에 model.pt 라는 모델 파일이 생성됩니다. 이 파일은 추가 이미지 스택 처리에 필요합니다.

5. 심박수 정량화

1. 2단계에서 설명한 대로 일련의 이미지를 기록합니다. 배율, 노출 시간, 조명과 같은 이미징 조건이 신경망 훈련에 사용되는 것과 동일한지 확인합니다.
2. AutoHR 애플리케이션을 실행합니다. 처리 탭으로 이동합니다. Choose Models(모델 선택)를 클릭하여 학습된 신경망 모델이 포함된 디렉터리를 선택합니다. Choose Folder 를 클릭하여 분석을 위해 획득한 이미지를 가져옵니다. 내보내기 경로는 자동으로 지정되지만 내보내기 경로 선택을 클릭하여 변경할 수 있습니다.  프로세스를 클릭하여 해석을 시작합니다.
   참고: 완료되면 심박수 값이 AutoHR 인터페이스의 심박수 필드에 나타납니다. 내보낸 폴더에는 심박수 값(.xlsx), PPG(.xlsx), 시퀀스의 첫 번째 프레임, 첫 번째 프레임(.png)의 바디 및 아이 마스크가 포함됩니다.

6. 알고리즘 결과 검증

1. 아래 설명된 대로 움직이지 않는 물고기로 테스트를 수행합니다.
   1. 0.168 mg/L MS-222 용액으로 유충을 1분 동안 마취합니다. 2단계에서 설명한 대로 마취된 표본의 이미지 스택을 획득합니다. 육안 관찰을 통해 심박수 수를 계산합니다.
   2. 5단계에서 설명한 대로 HR 소프트웨어를 활용합니다. 여러 시편에 대해 단계를 반복합니다. 얻은 심박수 값이 원하는 정확도 내에서 모든 개인에 대해 일관되는지 확인합니다.
2. 아래 설명된 대로 모바일 개인 및 도발 테스트로 테스트를 수행합니다.
   1. 2단계에서 설명한 대로 마취되지 않은 표본의 이미지 스택을 획득합니다. 심박수에 영향을 미치는 알려진 자극을 사용하여 시퀀스가 기록된 개인과 함께 도발 테스트를 수행합니다. 이 연구는 5mg/L의 농도로 물 염분화에 대한 결과를 제시합니다.
   2. 도발 테스트 후 2단계에서 설명한 것과 동일한 표본의 이미지 스택을 획득합니다. 5단계에 설명된 대로 HR 소프트웨어를 사용한 두 실험 모두에서 심박수를 확인합니다. 관찰된 심박수 변화가 유발 테스트의 알려진 효과와 일치하는지 확인합니다.

결과

12 dpf에서 제브라피쉬의 심박수는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 결정되었습니다(보충 비디오 1). 비디오에는 자유롭게 헤엄치는 제브라피시 유충의 이미지 시퀀스, 제안된 프로토콜을 사용하여 이러한 시퀀스에서 파생된 광용류측정, 광용적맥파에서 계산된 해당 심박수가 포함되어 있습니다.

레이블이 지정된 데이터는 훈련 중에 ...

토론

이 연구에서는 자유롭게 수영하는 제브라피시 유충의 심장 박동을 측정하기 위한 실험 프로토콜을 제시합니다. 우리는 여러 가지 실험을 통해 이 접근 방식을 평가하여 그 효과를 입증했습니다. 제안된 방법의 핵심 구성 요소에는 하드웨어 및 소프트웨어 솔루션이 모두 포함됩니다. 첫째, 이미징을 위해 적외선 조명을 사용했는데, 이는 앞서 설명한 바와 같이 색소 침착?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Low melting agarose	Biozym	850111
Table salt	Pegasus	N/A
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10505	MS-222
Equipment
Base with rod	Altami	SM-U1
Collimator lens	JLLSCMGGX		Focal length 30 mm
Focusing mechanism	Altami	SM-12	D=76 mm
LED	Cree	TR-3535IR-3W
Lens	SFK Security		C-Mount, F1.6, 1/3”,
Near infrared camera	ToupTek	SWIR1300KMA
Pasteur pipette	PE-LD	149293
Petri Dish 35 x 15 mm	BD Falcon	351008
Plastic forms	N/A	N/A	Made by 3D printing
Power supply	Unit-T	UTP3300TFL-II
Stage	N/A	N/A	Made by 3D printing
Stationery knife	ErichKrause	19145
Test object	Wally Sky	MS-1-EB
Software
EfficientDet	N/A	N/A	https://github.com/rwightman/efficientdet-pytorch
EfficientNet-b0 model	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/1905.11946
Google API Client	Google	N/A	Google API Client is a Python client library for Google's discovery-based APIs. https://github.com/googleapis/google-api-python-client
Hardware
Multi-scale attention network	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/2209.14145
NVIDIA DIGITS	NVIDIA	N/A	NVIDIA DIGITS is a wrapper for Caffe that provides a graphical web interface. https://developer.nvidia.com/digits
NVIDIA GPU	NVIDIA	N/A	An NVIDIA GPU is needed as some of the software frameworks below will not work otherwise. https://www.nvidia.com
OpenCV	Intel	N/A	OpenCV is a library for computer vision. https://opencv.org
Python	Python Software Foundation	N/A	Python is a programming language. https://www.python.org