Измерение сердцебиения без анестезии у свободно движущихся рыбок данио

Резюме

Исследование направлено на разработку технологии измерения сердцебиения без анестезии у движущихся рыбок данио. Наш подход сочетает в себе коротковолновую инфракрасную визуализацию и отслеживание сердца на основе машинного обучения. Это неинвазивный, не требующий меток и удобный для пользователя метод, который подходит для широкого спектра исследований на модели рыбок данио.

Аннотация

Рыбка данио (Danio rerio) является широко используемым модельным организмом в физиологических, фармакологических и токсикологических исследованиях благодаря своему генетическому сходству с человеком и прозрачной эмбриональной стадии, что облегчает неинвазивные исследования сердечно-сосудистой системы. Тем не менее, современные методы оценки частоты сердечных сокращений у рыбок данио часто полагаются на анестезию для иммобилизации субъекта, внося физиологические изменения, которые ставят под угрозу точность и воспроизводимость данных. В этом исследовании представлена новая, не требующая анестезии методика измерения сердцебиения у свободно движущихся личинок данио-рерио, устраняющая критическое ограничение в исследованиях сердечно-сосудистой системы. Предлагаемый подход объединяет коротковолновую инфракрасную визуализацию с отслеживанием сердца на основе машинного обучения, что позволяет осуществлять точный и непрерывный мониторинг сердечной деятельности у неиммобилизованных образцов. Сверточная нейронная сеть была обучена для обнаружения области сердца, а фотоплетизмографический сигнал был извлечен из последовательностей изображений для определения частоты сердечных сокращений. Экспериментальная валидация продемонстрировала надежность и согласованность метода в различных условиях испытаний. Ключевым преимуществом методики является ее способность сохранять естественное физиологическое состояние рыбок данио, сводя к минимуму артефакты, вызванные стрессом. Этот неинвазивный, не требующий меток метод предлагает значительные преимущества для изучения физиологии сердечно-сосудистой системы, кардиотоксичности лекарств и токсикологии окружающей среды, расширяя потенциальное применение рыбок данио в качестве модели для биомедицинских исследований.

Введение

Данио рерио (Danio rerio), маленькая карповая рыба, стала важным модельным организмом из-за своего небольшого размера, высокой репродуктивной способности и простоты генетических манипуляций ^1,2,3. Оценка частоты сердечных сокращений у прозрачных эмбрионов рыбок данио все чаще используется в физиологии, эмбриологии, токсикологии и других областях 4,5,6,7,8. С одной стороны, эта полезность обусловлена тем, что геном рыбки данио включает гены, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями человека⁹, а сердце Danio rerio имеет схожие структуры и сигнальные пути с человеком^10,11. Это делает рыбок данио бесценной моделью для изучения развития сердца и болезней 11,12,13. С другой стороны, частота сердечных сокращений рыбок данио чувствительна к внешним воздействиям, что делает ее отличной моделью для физиологических и токсикологических исследований путем сравнения сердечной функции у обработанных и необработанных рыб ^7,8,14.

Значительный прогресс достигнут в разработке неинвазивных оптических методов оценки частоты сердечных сокращений у прозрачных эмбрионов рыб ^15,16. Преимущество этих методов заключается в быстром сборе данных из больших объемов выборки. В связи с этим были разработаны полностью автоматизированные подходы к оценке частоты сердечных сокращений у эмбрионов рыб 4,5,6,17.

Тем не менее, некоторые ограничения в настоящее время ограничивают использование этих методов периодом в 3-4 dpf. Первое ограничение – потеря прозрачности из-за пигментации тела рыбы. Во-вторых, это увеличение подвижности эмбрионов с течением времени. Продление периода раннего развития данио-рерио, в течение которого можно использовать оптические подходы, повысит их полезность, что позволит в долгосрочных экспериментальных проектах изучать кардиомиопатию, врожденные пороки сердца и различные воздействия на сердечно-сосудистую систему, включая отслеживание динамики эффектов с течением времени. Недавно наша группа обратилась к проблеме потери прозрачности, используя визуализацию в коротковолновом инфракрасном диапазоне 900-1700 нм¹⁸. В данной статье основное внимание уделяется рассмотрению вопроса подвижности эмбрионов.

Как правило, анестетики, такие как трикаин метансульфонат (MS-222), используются для иммобилизации свободно плавающих эмбрионов и личинок рыб перед визуализацией 14,19,20. Тем не менее, MS-222 значительно снижает частоту сердечных сокращений^21,22, как и другие анестетики²³. Становится трудно определить, являются ли наблюдаемые изменения в работе сердца результатом экспериментального лечения, анестезии или взаимодействия между ними. Еще одним способом продления периода низкой подвижности эмбриона является снижение температуры на^{ранних стадиях развития}. Однако такой подход не всегда совместим с целями исследования и лишь минимально продлевает срок регистрации.

В этом исследовании мы представляем новый метод решения проблемы подвижности эмбриона во время регистрации частоты сердечных сокращений. Мы обучили сверточную нейронную сеть для идентификации интересующей области сердца в записях свободно плавающих эмбрионов данио-рерио. Периодическое изменение интенсивности пикселей в этой области используется для получения фотоплетизмограммы (ФПГ), которая впоследствии используется для расчета частоты сердечных сокращений. Разработанное настольное приложение AutoHR использовало как обучение нейронной сети, так и обработку стека изображений, обеспечивая простоту использования и воспроизводимость протокола.

протокол

Данио-рерио были выведены и выращены в соответствии с установленными протоколами ZFIN²⁴. Все процедуры утверждены Комитетом по биоэтике Научно-технологического центра уникального приборостроения Российской академии наук (НТЦ УИ РАН), протокол #3/24 от 21.08.2024 г., и соответствуют рекомендациям НТЦ УИ РАН по уходу за рыбками данио-рерио. Инструкции для отдельных версий предоставляются по запросу.

1. Подготовка оборудования к измерениям

1. Подбор оборудования
   1. Выберите источник света: Выберите светодиодный источник света, который излучает в ближнем инфракрасном диапазоне, а именно от 800 нм, с минимальной выходной мощностью 3 Вт. В этом исследовании использовался светодиод с центральной длиной волны 940 нм и полосой пропускания 40 нм.
   2. Выберите видеокамеру: выберите камеру, оснащенную сенсором, чувствительным к диапазону длин волн, излучаемых источником света, и имеющую частоту кадров не менее 60 кадров в секунду. Обратитесь к техническому описанию камеры, чтобы определить шаг пикселя p, размер сенсора вдоль его короткой стороны h и частоту кадров. В данном исследовании камера имеет шаг пикселя p = 5 μm и ширину сенсора h = 5,12 мм.
   3. Выбирайте размер агарозной формы, который как минимум в 1,5 раза больше длины личинки В. Вычислите минимальное и максимально допустимое увеличение оптической системы с помощью предоставленных выражений. Убедитесь, что M_max ≤ M_min. Если это условие не выполняется, выберите камеру с большим h и/или меньшим и/или меньшим S.
      
      
      где S_max — длина самой большой агарозной формы из набора форм. Может быть подготовлен набор формочек различных размеров. В этом исследовании использовался S = 10 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уравнения выведены на основе геометрии оптической схемы и пропорций тела рыбок данио. Подробные пояснения приведены в разделе «Обсуждение».
   4. Выберите объектив: В этом исследовании использовалась оптическая система с переменным увеличением в диапазоне от M_OSmin = 0,4x до M_OSmax = 1,5x, максимальным фокусным расстоянием f_max = 150 мм и рабочим расстоянием мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Символ x обозначает коэффициент увеличения оптической системы.
      1. Выбирайте систему микроскопа с переменным увеличением с диапазоном увеличения (M_OSmin - M_OSmax), который остается в пределах допустимого диапазона (M_min - M_max). Обратитесь к техническому описанию объектива, чтобы определить максимальное фокусное расстояние f_max и соответствующее рабочее расстояние L для M_OSmax.
      2. Убедитесь, что условие f_max ≤ M_max • L выполнено. Если это условие не выполняется, выберите объектив с другими значениями f_max и/или L. Убедитесь, что тип крепления камеры и объектива совместим.
   5. Выберите тестовый объект (линейку или сетку) с известным шагом и общей длиной не менее . Выберите тестовый объект в виде линейки или сетки с известным шагом и общим размером не менее S_max.
2. Сборка стенда для получения изображения (рисунок 1).
   1. Установите круглый стержень на устойчивое основание. Соберите систему обработки изображений, прикрепив объектив к камере. Установите канал изображения на стержень входным окном вверх.
   2. Установите фокусировочный механизм на стержень. Прикрепите к фокусировочному механизму столик со стеклянной рабочей поверхностью диаметром не менее 30 мм.
   3. Соберите осветитель: поместите светодиод на металлическую подложку, чтобы обеспечить эффективный отвод тепла. Поместите выпуклую плоскую линзу коллиматора диаметром 23 мм и фокусным расстоянием 30 мм на расстоянии 30 мм от светодиода.
   4. Установите осветитель на сцене с помощью регулируемого по трем осям кронштейна, расположив его над рабочей поверхностью линзой вниз.
   5. Отрегулируйте осветитель и систему формирования изображения. Расположите осветитель соосно с системой формирования изображения. Включите осветитель и подключите фотокамеру к компьютеру.
   6. Запустите приложение камеры и активируйте режим предварительного просмотра, следуя инструкциям в руководстве к камере. Поместите тестовый объект на рабочую область. Отрегулируйте рабочее расстояние и увеличение микроскопа, чтобы размер полностью вписывался в поле зрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер должен полностью соответствовать короткой стороне рамы, чтобы обеспечить полную визуализацию агарозной формы.
   7. Отрегулируйте положение предметного столика относительно системы формирования изображения, чтобы убедиться, что изображение сфокусировано, а положение осветителя освещено равномерно.
3. Приготовление агарозной плесени
   1. Смешайте 20 мл дистиллированной воды с 0,4 г малоплавкой агарозы и нагрейте смесь до полного растворения агарозы. Например, в микроволновке в течение 20 с при мощности 700 Вт.
   2. Придайте форму агарозе (Способ 1): Налейте нагретый раствор в чашку Петри, обеспечив высоту раствора 1,5-2 мм. Остудите чашку Петри до тех пор, пока раствор агарозы не застынет. При температуре 17 °C этот процесс занимает около 5 минут. Вырежьте квадрат со стороной длины с помощью канцелярского ножа и аккуратно удалите слой агарозы в пределах намеченного участка.
   3. Придайте форму агарозе (Способ 2): Создайте (S)× (S) × 10 мм, формы из пластика. Поместите распечатанную форму квадратной стороной в чашку Петри и заполните ее подогретым раствором, обеспечив высоту раствора 1,5-2 мм. Остудите чашку Петри до тех пор, пока раствор агарозы не застынет, и аккуратно выньте форму из застывшего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формы можно легко распечатать с помощью 3D-принтера.

2. Получение изображения

1. Отрегулируйте параметры захвата изображений.
   1. Подключите фотокамеру к компьютеру. Запустите приложение камеры и включите режим предварительного просмотра. Включите осветитель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если размер используемой агарозной формы отличается от указанного в шаге 1.3.3, повторите шаг 1.3.3 и после этого удалите испытуемый объект из этапа.
   2. Поместите личинку данио-рерио в агарозную форму с помощью пастеровской пипетки. Поставьте на сцену форму из агарозы. Обеспечьте почти полное освещение головы личинки, регулируя комбинацию времени экспозиции и мощности осветителя (рис. 2A-C). Время экспозиции не должно превышать 1,5 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы представляем данные о личинках дикого типа данио-рерио в возрасте от 12 до 21 дня после оплодотворения (dpf).
2. Получение изображений
   1. Установите частоту кадров не менее 60 кадров в секунду. Установите битовую глубину изображения на 12 бит. Получайте изображения в течение не менее 10 секунд. Установите формат именования кадров на yyyy_mm_dd_hh_ss_mm_mss, а тип файла должен быть PNG или TIFF, а не BMP.

3. Обучение нейронной сети маркировке

1. Подготовка данных для маркировки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описан процесс маркировки в приложении Image Labeler, MATLAB.
   1. Соберите не менее 256 полученных изображений в отдельную директорию. Запустите приложение. Импортируйте изображения, перейдя в раздел «Импорт > из файла » и выбрав все изображения из указанного каталога.
   2. Создание классов для маркировки сети. На вкладке Метки ROI нажмите Метка, введите тело в поле Название метки, выберите Метка пикселя в раскрывающемся меню для типа метки и нажмите кнопку ОК. На вкладке «Метки ROI» нажмите «Метка», введите глаз в поле «Название этикетки», выберите «Метка пикселя» в раскрывающемся меню для типа метки и нажмите «ОК». На вкладке Метки ROI нажмите Метка, введите рыбу в поле Имя метки, выберите Прямоугольник в раскрывающемся меню для типа метки и нажмите кнопку ОК.
2. Маркировка рам
   1. На вкладке Метки ROI выберите ранее созданный класс аннотаций, глаз. Наметьте один глаз образца, разместив точки по его периметру с помощью левой кнопки мыши. Чтобы завершить аннотацию глаза, нажмите на начальную точку контура (рисунок 3B).
   2. Обведите контуром другой глаз образца таким же образом, как описано в шаге 3.1.2.
   3. На вкладке Метки ROI выберите созданный класс аннотации, тело. Наметьте тело образца, исключив глаза, расставив точки по его периметру с помощью левой кнопки мыши. Чтобы завершить аннотацию глаза, нажмите на Начальную точку контура.
   4. На вкладке ROI Labels выберите ранее созданный класс аннотаций, fish. Обведите контуром все тело образца, нарисовав прямоугольную ограничивающую рамку (рисунок 4). Для этого кликните левой кнопкой мыши по One Corner предполагаемого прямоугольника, затем перетащите курсор, удерживая кнопку нажатой, пока прямоугольник полностью не закроет рыбу.
   5. Сохраните контуры в новом каталоге с именем images, нажав кнопку «Экспортировать > в файл » на вкладке «МЕТКА».
3. Подготовка наборов данных для обучения нейронной сети
   1. Запустите MATLAB. Откройте файл скрипта DatasetsPreparation.m (Дополнительный файл 1), выбрав Открыть > Открыть.
   2. Запустите скрипт, нажав кнопку Выполнить. Во всплывающем окне выберите директорию, содержащую обведенные изображения, папку PixelLabelData и файл gTruth.mat, который был экспортирован на шаге 3.2.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По завершении выполнения скрипта будут автоматически сгенерированы две папки - RPN Training и CNN Training. Они необходимы для последующего обучения нейронной сети. Не изменяйте содержимое этих папок.

4. Обучение нейронных сетей для детектирования сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется один раз для определенного возраста и состояния визуализации. Для тренировки настоятельно рекомендуется использовать графический процессор NVIDIA, так как он значительно ускоряет обработку.

1. Запустите приложение AutoHR. Перейдите на вкладку Обучение сети региональных предложений. Нажмите «Выбрать каталог » и выберите папку RPN Training , созданную на шаге 3.3.2. Нажмите «Начать обучение».
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения обучения файл модели с именем rpn_model.pt будет сгенерирован в том же каталоге, что и файл AutoHR.exe. Этот файл необходим для дальнейшей обработки стека изображений.
2. Чтобы обучить сверточную нейронную сеть, перейдите на вкладку Обучение сверточной нейронной сети. Нажмите «Выбрать каталог » и выберите папку «Обучение CNN», созданную на шаге 3.3.2. Нажмите «Начать обучение».
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения обучения файл модели с именем model.pt будет сгенерирован в том же каталоге, что и файл AutoHR.exe. Этот файл необходим для дальнейшей обработки стека изображений.

5. Количественная оценка частоты сердечных сокращений

1. Запишите последовательность изображений, как описано в шаге 2. Убедитесь, что условия визуализации, такие как увеличение, время экспозиции и освещенность, идентичны тем, которые используются для обучения нейронной сети.
2. Запустите приложение AutoHR. Перейдите на вкладку Обработка. Выберите каталог с обученными моделями нейронных сетей, нажав кнопку Выбрать модели. Нажмите «Выбрать папку », чтобы импортировать полученные изображения для анализа. Путь экспорта будет указан автоматически, но вы можете изменить его, нажав « Выбрать путь экспорта».  Нажмите кнопку Обработать , чтобы начать анализ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения значение частоты сердечных сокращений появится в поле «Частота сердечных сокращений» в интерфейсе AutoHR. Экспортированная папка будет содержать значения частоты сердечных сокращений (.xlsx), PPG (.xlsx), первый кадр последовательности, а также маски тела и глаз для первого кадра (.png).

6. Проверка результатов алгоритма

1. Проведите тест с неподвижной рыбой, как описано ниже.
   1. Обезболить личинок раствором MS-222 в дозе 0,168 мг/л в течение 1 мин. Получите стек изображений образца, находящегося под наркозом, как описано в шаге 2. Выполните подсчет частоты сердечных сокращений с помощью визуального наблюдения.
   2. Используйте программное обеспечение для управления персоналом, как описано в шаге 5. Повторите шаги для нескольких экземпляров. Проверьте, согласуются ли полученные значения частоты сердечных сокращений для всех людей с желаемой точностью.
2. Проведите тест с мобильным человеком и провокационный тест, как описано ниже.
   1. Соберите стек изображений образца без анестезии, как описано в шаге 2. Проведите провокационный тест с человеком, для которого была записана последовательность, с использованием известного стимула, влияющего на частоту сердечных сокращений. В исследовании представлены результаты по засолению воды до концентраций 5 мг/л.
   2. Получите стек изображений того же образца, как описано в шаге 2, после провокационного теста. Определите частоту сердечных сокращений в обоих экспериментах с помощью программного обеспечения для измерения ЧСС, как описано в шаге 5. Проверьте, согласуются ли наблюдаемые изменения частоты сердечных сокращений с известными эффектами провокационного теста.

Результаты

Частоту сердечных сокращений рыбок данио рерио при 12 dpf определяли с помощью описанного выше протокола (Дополнительное видео 1). Видео включают в себя последовательность изображений свободно плавающих личинок данио-рерио, фотоплетизмограмму, полученную из э...

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем экспериментальный протокол измерения сердцебиения свободно плавающих личинок данио-рерио. Мы оценили этот подход с помощью нескольких экспериментов, продемонстрировав его эффективность. Ключевыми компонентами предлагаемого ме?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Low melting agarose	Biozym	850111
Table salt	Pegasus	N/A
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10505	MS-222
Equipment
Base with rod	Altami	SM-U1
Collimator lens	JLLSCMGGX		Focal length 30 mm
Focusing mechanism	Altami	SM-12	D=76 mm
LED	Cree	TR-3535IR-3W
Lens	SFK Security		C-Mount, F1.6, 1/3”,
Near infrared camera	ToupTek	SWIR1300KMA
Pasteur pipette	PE-LD	149293
Petri Dish 35 x 15 mm	BD Falcon	351008
Plastic forms	N/A	N/A	Made by 3D printing
Power supply	Unit-T	UTP3300TFL-II
Stage	N/A	N/A	Made by 3D printing
Stationery knife	ErichKrause	19145
Test object	Wally Sky	MS-1-EB
Software
EfficientDet	N/A	N/A	https://github.com/rwightman/efficientdet-pytorch
EfficientNet-b0 model	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/1905.11946
Google API Client	Google	N/A	Google API Client is a Python client library for Google's discovery-based APIs. https://github.com/googleapis/google-api-python-client
Hardware
Multi-scale attention network	N/A	N/A	https://arxiv.org/abs/2209.14145
NVIDIA DIGITS	NVIDIA	N/A	NVIDIA DIGITS is a wrapper for Caffe that provides a graphical web interface. https://developer.nvidia.com/digits
NVIDIA GPU	NVIDIA	N/A	An NVIDIA GPU is needed as some of the software frameworks below will not work otherwise. https://www.nvidia.com
OpenCV	Intel	N/A	OpenCV is a library for computer vision. https://opencv.org
Python	Python Software Foundation	N/A	Python is a programming language. https://www.python.org