وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من البنك السعودي الفرنسي الولايات المتحدة وإسرائيل لدرجة البكالوريوس وEDSBS هو شاغل كرسي هيلدا وسيسيل لويس استاذي في علم الوراثة الجزيئي.

ملاحظة: الإجراءات التي تجرى على الحيوانات وقد تمت الموافقة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في معهد وايزمان للعلوم. إعداد 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل عنيبات ​​البنكرياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 300 مل من الطازجة بيكربونات كريبس-قارع الأجراس HEPES (KRBH) متوسطة قبل البدء. مزيج كلوريد الصوديوم 140 ملم، 4.7 ملم بوكل، 1.16 ملم MgCl 2، 1 مم CaCl 2 و 11 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES. إضافة ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا (STI) (إعادة تعليق المتوسطة). إعداد 5-10 مل من إعادة تعليق تستكمل المتوسطة مع كولاجيناز (~ 0.75 ملغ / مل) (وسط الهضم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوكسجين المتوسط ​​KRB ل~ 30 دقيقة. إضافة BSA بعد الأوكسجين لمنع محتدما. إعادة تعليق الهضم وجلب وسائل إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: بالاكسجين المتوسط ​​يقلل وفيات الخلية ويحسن القدرة على الاستجابة للsecretagogues. تأثير الأوكسجين هو ظاهر على الأقل لمدة 6 ساعة. </li><lط&gt; تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم أو CO 2 الخنق، وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المؤسسية. وضع الحيوان ضحى على ظهرها، ونعلق عليه إلى لوحة تشريح وتنظيف السطح البطني مع الايثانول. ملاحظة: من أجل تجنب التلوث، الأوتوكلاف أدوات تشريح والمياه المستخدمة في KRBH المتوسطة قبل الاستخدام. تصفية KRBH المتوسطة من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قبل استئصال البنكرياس شطف الأدوات تشريح مع الايثانول 70٪ وإجراء تشريح على مقاعد البدلاء النظيفة. تنفيذ العدوى الفيروسية في مستوى 3 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إضافة المضادات الحيوية إلى O / N زراعة المتوسطة (انظر القسم 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال البنكرياس الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على نطاق واسع شق الجلد في البطن وطبقة تحت الجلد. التعرف على الكبد والمعدة والأمعاء والبنكرياس والطحال (الشكل 1). ملاحظة: في الخطوات التالية، والتعامل مع أنسجة البنكرياس بلطف وتجنب تطبيق forc الميكانيكية المفرطه لمنع السيارات الهضم وفاة الأنسجة والخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين ملقط حادة، سحب الأمعاء الدقيقة. تبدأ في نهاية الأمعاء الدقيقة القريبة، بالقرب من الخروج من المعدة. فصل البنكرياس من الأمعاء والاحتفاظ بها داخل تجويف الجسم. وبمجرد الوصول إلى الأمعاء الغليظة، لاحظ أ / النسيج الضام بيضاء وردية اللون. لا تخلط بين ذلك مع البنكرياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح قدر الأنسجة البنكرياس ممكن من دون جمع الأنسجة الدهنية أو الضامة. إزالة البنكرياس من قبل فصلها من الطحال والمعدة وقطع الأوعية الدموية في البطن تحته (الشكل 1A-C). ملاحظة: بما أن العائد من عنيبات ​​البنكرياس من حيوان واحد مرتفع، ويمكن للمرء أن الامتناع عن جمع كل أنسجة البنكرياس من أجل منع جمع الأنسجة الأخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاجيناز الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف البنكرياس عدة مرات في إعادة تعليق المتوسطة تسخينها إلى 37 درجة مئوية وإزالة الأجزاء المتبقية من غير البنكرياسالأنسجة. تزج البنكرياس في ~ 5 مل من قبل ساخنة المتوسطة الهضم في 20 مل قارورة التلألؤ. تخطر على البنكرياس لقطعة من 1-3mm. وضعه في حمام الماء الساخن (الأمثل في إطار التحريض من ~ 100 دورة في الدقيقة). لتسريع الهضم، ماصة صعودا وهبوطا الأنسجة هضمها مرة واحدة كل بضع دقائق. ملاحظة: مدة كولاجيناز الهضم تعتمد بشكل رئيسي على تركيز كولاجيناز وعلى مقدار القوة الميكانيكية المطبقة على الأنسجة. استخدام 0.75 ملغ / مل كولاجيناز لحوالي 15 دقيقة وpipetting لالأنسجة مع ماصة 5 مل البوليسترين مع 2 مم فوهة كل 3-5 دقيقة، مما أدى إلى عنيبات ​​من 10-30 الخلايا. بعد الهضم، وتعليق يبدو العكرة التي تحتوي على قطع مرئية من الأنسجة. منذ collagenases الكفاءة تختلف بين أنواع مختلفة تجارية والكثير، وتحديد توقيت الهضم تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغسيل والترشيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة هضمها في أنبوب 50 مل وإنهاء حفرestion بإضافة 45 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تصفية تعليق من خلال الخشنة (~ 1 ملم) شبكة معدنية إلى أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق في 100 × ز لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ومعلق البنكرياس هضمها في 50 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تصفية تعليق من خلال 70 أو 100 ميكرومتر شبكة النايلون. الطرد المركزي كما كان من قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إزالة العائمة، عنيبات ​​التالفة، تجاهل طاف و resuspend الأنسجة في البنكرياس 3-5 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تطبيق 1 مل أجزاء من عنيبات ​​البنكرياس إلى 15 مل أنابيب مخروطية مليئة 7 مل من إعادة تعليق المتوسطة. السماح للعنيبات ​​ليستقر عن 2 - 3 دقيقة. جمع عنيبات ​​التي استقرت في قاع الأنبوب مع ماصة 1 مل، وتكرار هذه الخطوة 2 - 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض عنيبات ​​البنكرياس تحت المجهر الخفيفة أو تشريح لاختبار حالتهم. في الشكل 2، ومراقبة نقاوة العزلة والأضرار التي لحقت الخلايا الدورينانوغرام العزلة. استخدام هذه عنيبات ​​فورا أو الثقافة لمدة تصل إلى 20 ساعة. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. الأميليز إفراز الفحص ملاحظة: يقدم فحص إفراز الأميليز كمقياس عالمي لقدرة إفرازية من عنيبات ​​البنكرياس. ويتحقق ذلك من خلال جمع المتوسطة التي حضنت عنيبات ​​البنكرياس، وتحديد النشاط الأميليز من المتوسط، عادة باستخدام عدة التجارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد من الشروط التجريبية ليتم فحص (مقابل مثل غير حفز حفز). استخدام لا يقل عن ثلاثة مكررات لكل حالة. بالإضافة إلى ذلك، إضافة مجموعة من مكررات لتحديد المحتوى الكلي الخلوي الأميليز (&#39;مجموع&#39; عينة) ومجموعة للنشاط الأميليز من المتوسط ​​(عينة &quot;الصفر&quot;). تسمية لوحة متعددة جيدا التي ستجرى الفحص، ومجموعتين من microtubes لكل من مكررات لاستخدامها. ملاحظة: 12- أو 24 لوحة جيداق يمكن استخدامها لرصد 1 و 0.5 مل من تعليق عنيبية، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل عنيبات ​​مرتين في 30 مل من إعادة تعليق KRBH المتوسطة واحتضان لهم في إعادة تعليق متوسطة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لوحة متعددة جيدا إضافة قطرة 10μl من افراز للوصول إلى التركيز النهائي المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عنيبات ​​البنكرياس تستجيب إلى التدرج من افراز بطريقة ثنائية طوري. تركيزات مع القيم المثلى هي إفراز 50-100 من مساء كوليسيستوكينين (CCK) و1μM من كرباكول (الشكل 3A) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل و resuspend عنيبات ​​في إعادة تعليق المتوسطة. تأكد من أن عنيبات ​​توزع متجانس في تعليق وقسامة كميات متساوية من تعليق في لوحة متعددة جيدا والى &quot;microtubes المسمى total&#39;. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. (يفضل أن يكون في حمام مائي في إطار التحريض معتدل (~ 50 دورة في الدقيقة)). ملاحظة: العدد الدقيق للعنيبات ​​قد تختلف بين التجربهTS لكن يجب ان يكون مماثلا في مكررات في كل تجربة. وبالتالي، aliquoting الدقيق للتعليق عنيبات ​​أمر بالغ الأهمية لمقارنة بين مكررات وظروف مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة، وإنتاج &quot;الكل&quot; والعينات &quot;الصفر&quot;. أجهزة الطرد المركزي في &quot;المجموع&quot; microtubes لبضع ثوان في 5،000 × ز وإزالة 50 ميكرولتر من طاف في &quot;microtubes zero&#39; المسمى ووضعها في 4 درجات مئوية. ليز عنيبات ​​في &quot;المجموع&quot; عينات بإضافة تريتون X-100 إلى microtubes للوصول إلى تركيز النهائي من 1٪. دوامة microtubes بقوة. ملاحظة: Aliquote في &quot;المجموع&quot; يتطابق مماثل لمكررات التجربة. Lysing وعنيبات، يؤدي إلى الإفراج عن المحتوى الكلي الأميليز. بدلا من ذلك، جمع عنيبات ​​في كل حالة وليز في نهاية التجربة، لتحديد محتوى الخلوي للكل تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع معظم عنيبية تعليق طn لأول مجموعة من microtubes صفت مسبقا. الطرد المركزي microtubes لبضع ثوان في 5،000 × ز. نقل طاف في المجموعة الثانية من microtubes صفت مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة طاف للنشاط الأميليز مع مجموعة تجارية. حساب النسبة المئوية من يفرز الأميليز. ملاحظة: من المهم جدا لقراءة النشاط الأميليز في مجموعة خطية لها. تقديم نسبة الأميليز يفرز مثل الأميليز في المئة من المفرج عنهم من المحتوى الأولي الكلي. طرح مستوى الأميليز خلفية المتوسطة من كل ثلاث نسخ ونقسمه على المحتوى الكلي الأولي تطبيع بالمثل. </li></ol> 3. تصوير لايف من إفراز البنكرياس إفراز من عنيبات ​​البنكرياس يمكن رصدها مباشرة بواسطة التصوير الحي. باستخدام مختلف الأصباغ الفلورية وأجهزة الاستشعار، والتصوير الحي يسمح توصيف إفراز في قرار شبه الخلوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المؤكسج حديثا المتوسطة إعادة تعليق وكما قلتن خطوة 1.1 وإحضاره إلى 37 درجة مئوية. تعيين المجهر، وإذا مجهزة تحكم في درجة الحرارة، وضبط إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا عنيبية في 30 مل من إعادة تعليق متوسطة ووضعها في كوب أو البلاستيك الشريحة. ملاحظة: إذا الأصباغ محبة للدهون سوف تستخدم لتسمية لغشاء البلازما المسمى مع الأصباغ محبة للدهون، وصمة عار على عنيبات ​​مدة لا تزيد عن 5 دقائق لمنع وضع العلامات الأغشية الداخلية من خلال الإلتقام. في جميع أنحاء العمل، والتعامل مع عنيبات ​​بلطف وتجنب pipetting لالمفرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على المجهر، صورة عنيبات ​​التي التشكل هو واضح، وتجنب التصوير من عنيبات ​​التي تعرض الفقاعات basolateral أو فجوات داخل الخلايا. إضافة قطرة افراز الحكمة أو باستخدام غرفة التروية، إما أثناء أو مباشرة قبل بدء التصوير. ملاحظة: عدسات التكبير عالية مع فتحات رقمية عالية (مثل × 63 / 1.4 × 100 أو / 1.4) ويوصى لمراقبة الهياكل التحت خلوية. </li></ol> 4. O / N ثقافة البنكرياس عنيبات ​​(خلية البديل ثقافة وتقنيات) ملاحظة: O / N غالبا ما تستخدم لزراعة عدوى فيروس الغدة. تتم الإصابة بها في 10 -10 6 7 PFU / مل ل9 - 16 ساعة قبل الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة عنيبات ​​البنكرياس لمدة تصل إلى 20 ساعة. عنيبات ​​معلق تم الحصول عليها من البنكرياس واحدة في 25 مل مستنبت (DMEM تستكمل مع مصل العجل الجنين (FCS) (5٪)، الصوديوم البيروفات (1٪)، والمضادات الحيوية (1٪)، L-الجلوتامين (0.5٪)، BSA (10 ملغ / مل) والأمراض المنقولة جنسيا (0.2 ملغ / مل)، وتنقسم إلى خمس لوحات 10CM. تصيب عنيبات ​​مع الفيروس في مستوى 3 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حضنت عنيبات ​​البنكرياس في 37ºC في 5٪ CO 2 ترطيب الهواء. تسمح عنيبات ​​لاسترداد في المؤكسج المتوسطة إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة قبل الفحص اللاحق 3،8. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

إلى جانب الثقافة فيفو السابقين، الاجهزة البديلة لدراسة إفراز خارجية الإفراز وتشمل intravital المجهري وقياس السوائل من القناة البنكرياسية. وقد تبين intravital المجهري للعمل بشكل جيد في الماوس الغدد اللعابية 10. هذه الطريقة يمكن تسجيل إفراز في الوقت الحقيقي في الحيو?...

إفرازات البنكرياس يشكل أكثر من كتلة البنكرياس الثدييات و هو مخصص لإنتاج وإفراز الإنزيمات الهضمية 1. الوحدة الوظيفية للإفرازات البنكرياس، وعنيبة، هي مجموعة من الخلايا الظهارية التي تشكل وأسهم التجويف المشترك. على التحفيز الهرموني أو العصبية، ويتم نقل حويصلات مليئة الانزيمات لسطح الخلية قمي، فتيل معها وطرد محتوياتها في تجويف 1-3. ثم يتم استنزاف الإنزيمات التي يفرزها مجموعة تلاحم القنوات إلى الأمعاء الدقيقة، حيث حفز انهيار المواد الغذائية إلى المواد المغذية. يوضح هذا الفيديو كيفية عنيبات ​​سليمة يتم عزل من البنكرياس كله، وكيف يمكن تقييم قدرتها الإفرازية. باستخدام هذا الإعداد، يتم إفراز البنكرياس كميا عن طريق قياس كمية النسبي للالأميليز الذي تم إصداره بعد التحفيز. بدلا من ذلك، يمكن إفراز تصوير العيش من خلال استخدام مختلفأجهزة الاستشعار والأصباغ. الإعداد فيفو السابقين من عنيبات ​​البنكرياس هو مفيد منذ عنيبات ​​معزولة، التي تحتفظ بخصائص كثيرة من البنكرياس سليمة، يمكن التلاعب بها ومراقبتها بسهولة أكثر في الحيوان كله 4-6. وقد تم تطوير هذا الإعداد في الأصل في أواخر عام 1970 وكان منذ تمديدها لدراسة عدة أنسجة خارجية الإفراز مثل اللعابية والغدد الثديية 3-7. والجدير بالذكر، أنه يسمح للدراسة إفراز مع أقل تدخل ممكن للمنظمات الخلوية المعقدة لهذه الظهارة الاستقطاب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

عنيبية خلايا البنكرياس تنتج وتفرز الإنزيمات الهضمية. ويتم تنظيم هذه الخلايا باعتبارها الكتلة التي تشكل وأسهم التجويف المشترك. يوضح هذا العمل كيف أن قدرة إفرازية من هذه الخلايا يمكن تقييمها من قبل ثقافة عنيبات ​​معزولة. الإعداد هو مفيد منذ عنيبات ​​معزولة، التي تحتفظ بخصائص كثيرة من إفرازات البنكرياس سليمة يمكن التلاعب بها ومراقبتها بسهولة أكثر في الحيوان كله. العزلة السليمة للعنيبات ​​البنكرياس هو شرط أساسي بحيث ثقافة فيفو السابقين سوف تمثل الطبيعة في الجسم الحي من عنيبات. يوضح البروتوكول كيفية عزل عنيبات ​​سليمة من البنكرياس الماوس. بعد ذلك، يتم عرض طريقتين التكميلية لتقييم إفراز البنكرياس. يقدم فحص إفراز الأميليز كإجراء العالمي، بينما التصوير المباشر لإفراز البنكرياس يسمح توصيف إفراز في قرار شبه الخلوية. بشكل جماعي، وتقنيات حاضراتيد هنا تمكين طائفة واسعة من التجارب لدراسة إفراز خارجية الإفراز.

عنيبات ​​البنكرياس التي تم عزلها بشكل صحيح عرض مورفولوجيا النمطية عندما ينظر اليها من الضوء المرسل. يجب أن تظهر المجالات basolateral من جولة وخال من الفقاعات. ويحيط المجال قمية من قبل مئات من الحويصلات الإفرازية ويبدو أكثر قتامة في اللون (الشكل 2A، B). وتقع النواة ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

عنيبات ​​البنكرياس معزولة تحتفظ في الجسم الحي على التشكل والنشاط وتوفر وسائل قوية لرصد والتلاعب إفراز. يوضح هذا العمل كيف عنيبات ​​يمكن عزل من البنكرياس الماوس، وكيف يمكن تقييم قدراتها الإفرازية.

تقييم القدرة الإفرازية للخلايا البنكرياس عنيبية

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

assessing-the-secretory-capacity-of-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Views.  Weizmann Institute of Science.  عنيبات ​​البنكرياس معزولة تحتفظ في الجسم الحي على التشكل والنشاط وتوفر وسائل قوية لرصد والتلاعب إفراز. يوضح هذا العمل كيف عنيبات ​​يمكن عزل من البنكرياس الماوس، وكيف يمكن تقييم قدراتها الإفرازية. 

Video: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Murine Pancreatic Islet Isolation

فأري عزل جزيرة البنكرياس

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

زرع البنكرياس من الجزر في الكبسولة الكلى من الفئران من السكري

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الأول : الهضم ومجموعة من الأنسجة البنكرياس

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

إعداد خلايا البنكرياس عنيبية لغرض التصوير الكالسيوم، القياسات إصابة الخلية، وعدوى الفيروسة الغدانية

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Phenotyping ماوس الرئوي وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع قدرة الرئة نشرها

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

قدرة التمايز للخلايا الدهنية ارتشاح الابهري البشرية السلف

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

تقييم تفاعلات البروتين في الخلايا الحية مع انبعاث الحنق الحساس

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...