Name: assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells
Uploaded: 2014-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Bu çalışma BS ABD-İsrail BSF bir hibe ile finanse edildi ve EDSBS Moleküler Genetik Hilda ve Cecil Lewis profesörlük sandalyenin bir görevidir.

NOT: hayvan denekleri Prosedürleri Weizmann Bilim Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Pankreas asinüs izolasyonu <ol><li> Başlamadan önce taze Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) ortam 300 ml hazırlayın. 140 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 1.16 karıştırın mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 11 mM glikoz, 10 mM HEPES. Büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) (yeniden süspansiyon ortamı) ekleyin. Orta kollagenazının (~ 0.75 mg / ml) (sindirim ortamı) ile takviye edilmiş 10 ml yeniden süspansiyon - 5 hazırlayın. </li><li> ~ 30 dakika boyunca ortam KRB oksijenat. Köpüren önlemek için oksijenlenme sonra BSA ekleyin. 37 ° C resüspansiyon ve sindirim ortamlar getirin. NOT: orta Oksijenleyici hücre ölümlerini azaltır ve sekretagoglannın için yanıt geliştirir. Oksijenasyon etkisi en az 6 saat boyunca açıktır. </li><li&gt; kurumsal hayvan bakımı kurallarına göre, servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma fare Kurban. , Sırtında kurban hayvan koyun bir diseksiyon pad onu takın ve etanol ile karın yüzeyini temizleyin. NOT: kirlenmesini önlemek diseksiyon araçları ve kullanmadan önce KRBH ortamı için kullanılan suyun otoklavlamayın için. 0.2 um&#39;lik bir filtreden filtre ortamı KRBH. Önce pankreas çıkarılması için% 70 etanol ile diseksiyon araçları yıkayın ve temiz bir bankta diseksiyonu yürütmek. Seviye 3 biyo-güvenlik kabini viral enfeksiyonların yürütmek. O / N kültür ortamına antibiyotik ekleyin (Bölüm 4&#39;e bakınız). </li></ol></li><li> Murin pankreas eksizyonu <ol><li> Kesi yaygın karın deri ve deri altı tabaka. Karaciğer, mide, bağırsak, pankreas ve dalak (Şekil 1) tanımlayın. NOT: Aşağıdaki adımlarda, yavaşça pankreas dokusu işlemek ve aşırı mekanik FORC uygulamaktan kaçınıne doku ve hücre ölümüne otomatik sindirim önler. </li><li> İki künt forseps kullanarak, ince bağırsağa çekin. Mideden çıkışına yakın, ince barsak proksimal ucunda başlar. Bağırsaktan pankreas ayırın ve vücut boşluğunun içinde yerinde tutulması. Bir kez kalın bağırsağa ulaşan, pembe / beyaz bağ dokusu fark. Pankreas ile karıştırmayın. </li><li> Yağ veya bağ dokusu toplama olmadan mümkün olduğunca pankreas dokusu temizleyin. Dalak ve mide ayrılmakta ve karın kan damarları altındaki (Şekil 1A-C) keserek pankreas kaldırmak. NOT: Tek bir hayvandan alınan pankreas asinüs verimi yüksek olduğu için, bir başka dokular oluşmasını önlemek için tüm pankreas dokusu toplama kaçınırsan. </li></ol></li><li> Kolajenaz sindirimi <ol><li> Pankreas 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı yeniden süspansiyon ortamı içinde birkaç kez yıkayın ve pankreatik olmayan kalan bölümlerini kaldırmakdokular. Bir 20 mL sintilasyon şişesine önceden ısıtılmış bir sindirim ortamının ~ 5 ml pankreas bırakın. 1-3mm parçalarına pankreas kıyma. (Optimal olarak ~ 100 rpm çalkalama ile) ısıtılmış bir su banyosu içine koyun. Sindirim hızlandırmak için, sindirilmiş doku yukarı ve aşağı bir kez her birkaç dakikada bir pipetle. Not: kolajenaz sindirimi süresi esas olarak kolajenaz konsantrasyonu ve doku üzerinde uygulanan mekanik kuvvet miktarına bağlıdır. 30 hücre - 10 asinüs sonuçlanan 5 dak - 15 dakika boyunca, yaklaşık 0.75 mg / ml kollajenaz kullanımı ve 2 mm olan bir 5 ml&#39;lik pipet ile polistiren doku pipetle her 3 orifis. Sindirme işlemini takiben, süspansiyon doku görülebilir parçadan oluşan bulanık görüntülenir. Kalogenazlar verimleri farklı ticari tip ve sayıda arasında değişir bu yana, ampirik sindirim zamanlamasını belirler. </li><li> Yıkama ve filtreleme <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine sindirilmiş doku transferi ve kazı sonayeniden süspansiyon ortamı 45 ml ilave etmek suretiyle len. Bir kaba ile süspansiyon filtre (~ 1 mm), yeni bir tüpe, metal içine örgü. 3 dakika için akış yoluyla 100 × g santrifüj. </li><li> Süpernatant atılır ve yeniden süspansiyona alma ortamı, 50 ml dijeste pankreas yeniden süspanse edildi. 70 veya 100 mikron naylon örgü ile süspansiyon filtre. Önceki gibi santrifüj. </li><li> Resüspansiyon ortamın 5 ml -, yüzen, hasarlı asinüsü kaldırmak süpernatantı atmak ve 3 pankreas dokusu tekrar süspansiyon için. Yeniden süspansiyon ortamı 7 ml ile doldurulmuş 15 ml konik tüp içine pankreas asinüs 1 ml kısımlar uygulanır. 3 dakika - acininin 2 yerleşmek için izin verin. 1 ml&#39;lik bir pipet ile tüpün dibine yerleştirilmiş olan asinüsü toplamak ve bu adımı tekrar 2 - 3 defa. </li><li> Kendi durumunu test etmek için bir ışık veya diseksiyon mikroskobu altında pankreas asinüsü gör. Şekil 2&#39;de, İlginç tasarım hücreleri üzerinde açtığı izolasyon saflığını ve zararları gözlemlemekng izolasyon. Kadar 20 saat boyunca bu hemen asinüsü veya kültür kullanın. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Amilaz Salgı Testi Not: Amilaz salgılama tahlili pankreas asinüs salgılama kapasitesi için küresel bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Bu genellikle ticari bir kit kullanılarak, pankreas acininin inkübe edildiği ortamın toplanması, ve ortamın amilaz aktivitesinin belirlenmesi suretiyle elde edilir. <ol><li> Deneysel koşullar sayısının incelenecek belirlemek (örneğin, uyarılmamış genel uyarılmış). Her bir durum için en az üç suret kullanın. Buna ek olarak, ortam (&quot;sıfır&quot; örneği) amilaz aktivitesi için toplam hücresel amilaz içeriği (bakiyeleri örnek) ve bir kümesini belirlemek için replika kümesi ekleyin. Çok-çukurlu deney yapılacak olan plaka ve Her bir replika için mikro-tüpler iki takım etiketlemek kullanılır. NOT: 12 ya da 24 oyuklu plaka, sırasıyla, asinar süspansiyonlar 1 ve 0.5 ml izlemek için de kullanılabilir. </li><li> KRBH yeniden süspansiyon ortamı 30 ml iki kez asinüsü yıkayın ve 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca yeniden süspansiyon ortamı içine inkübe edin. Çok-çukurlu plaka için uygun nihai konsantrasyona ulaşmak için bir 10 ul salgılattırıcısı damla ekleyin. </li><li> Pankreas acininin çift fazlı bir şekilde salgılattırıcısı gradyanı yanıt. Kolesistokinin (CCK) ve 1 uM&#39;nin Karbakol&#39;ün (Şekil 3A), 100 uM 5 - uygun salgılama değerleri ile konsantrasyonları 50 bulunmaktadır. </li><li> Yıkama ortamı içinde yeniden süspansiyon ve asinüsü tekrar süspansiyon. Acininin çok kuyucuklu plaka içine ve &#39;total&#39; etiketli mikrotüpler içine süspansiyonun süspansiyon ve kısım eşit miktarlarda homojen olarak dağılmış olduğundan emin olun. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin. (Tercihen yumuşak çalkalama altında bir su banyosunda (~ 50 dak içinde)). NOT: asini tam sayısı experimen arasında değişebilirts her deneyde çoğaltır benzer olmalı ama. Bu nedenle, süspansiyonun tam acininin Alikotlama farklı tekrarlanmış ve koşullar arasında bir karşılaştırma için çok önemlidir. </li><li> İnkübasyon sırasında, &quot;toplam&quot; ve &quot;sıfır&quot; örneklerini üretmek. Santrifüj bakiyeleri 5000 x g &#39;de birkaç saniye mikrotüpler ve &quot;zero&#39; etiketli mikrotüpler içine süpernatandan 50 ul çıkarın ve 4 ° C&#39; de koyun. Mikro-tüplerin Lyse Triton X-100 eklenmesi ile bakiyeleri örnekleri acininin% 1 bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Kuvvetlice mikrotüpler vorteksleyin. NOT: &#39;Toplam&#39; deney çoğaltır benzer çoğaltır eşit olarak dağıtılır. Asinüsü parçalayan amilaz toplam içeriğinin açığa çıkmasına yol açar. Seçenek olarak ise, her deney hücresel içeriğini belirlemek için, deneyin sonunda, her bir durumda ve parçalanmasıyla de asinüsü toplanır. </li><li> Asiner süspansiyon i en toplayınönceden etiketlenmiş mikrotüplerde ilk kümesi Nto. 5.000 × g birkaç saniye boyunca mikrotüpler santrifüj. Önceden etiketlenmiş mikrotüpler ikinci sette içine süpernatant aktarın. </li><li> Ticari bir kit ile amilaz aktivitesi için yüzer maddeler sınama. Salgılanan amilaz yüzdesini hesaplayın. NOT: Bu lineer aralığında amilaz aktivitesini okumak için çok önemlidir. Ilk toplam içeriğine salınan amilaz yüzdesi olarak salgılanan amilaz yüzdesini sunulması. Her bir üç kopya medyumuyla arka plan düzeyi amilaz çıkarma ve benzer başlangıç ​​normalize edilmiş bir toplam muhtevası bölün. </li></ol> Pankreas Salgısının 3. Canlı Görüntüleme Pankreas asinüs salgılama, canlı görüntüleme ile doğrudan izlenebilir. Çeşitli floresan boyalar ve sensörlerini kullanarak, canlı görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar. <ol><li> Taze oksijenli resüspansiyon ortamı olarak hazırlayın in 1.1 adıma ve 37 ºC getirmek. Mikroskop ayarlayın ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmış ise, 37 ºC ayarlayın. </li><li> Yeniden süspansiyon ortamı 30 ml asinar hücreleri yıkayın ve bir cam ya da plastik slayt yerleştirin. Not: lipofilik boyalar, lipofilik boyalarla işaretlenmiş plazma zarı için etiket endositoz ile iç membran etiketleme önlemek için en fazla 5 dakika boyunca asinüsü leke için kullanılacak ise. Çalışma boyunca yavaşça asinüsü işlemek ve aşırı pipetleme kaçının. </li><li> Mikroskop kez at, kimin morfoloji görüntü acininin açıktır ve taban kabarcıklar ya da hücre içi vakuoller görüntülemek asini görüntüleme kaçının. Halinde ya da sırasında veya hemen önce görüntüleme başlamadan, ya bir perfüzyon odasına kullanılarak salgı damla ekleyin. NOT: Yüksek sayısal delikler ile yüksek büyütme lensler (örneğin × 63 / 1.4 veya 100 / 1.4 ×) hücre içi yapıları gözlemlemek için tavsiye edilir. </li></ol> 4. O / Pankreas asini N Kültürü (Alternatif Hücre Kültürü Tekniği) Not: O / N kültürlenmesi, genellikle adeno virüs enfeksiyonu için kullanılır. Tetkikten önce 16 saat - Enfeksiyon 9 10 6 -10 7 pfu / ml &#39;de gerçekleştirilir. <ol><li> En fazla 20 saat boyunca kültür pankreatik acininin. 25 ml kültür ortamı (DMEM tek pankreasından elde edilen yeniden süspansiyon haline acininin fetal buzağı serumu (FCS) (% 5), sodyum-piruvat (1%), antibiyotikler (% 1), L-glutamin (% 0.5), BSA ile desteklenmiş (10 mg / ml) ve STI (0.2 mg / ml) ve 10 cm plakalar beş ayrılmıştır. seviye 3 biyo-güvenlik kabininde virüs ile asinüsü Infect. </li><li> % 5 CO2 nemlendirilmiş hava içinde 37 ° C&#39;de pankreas asinüsü kuluçkalanmıştır. Acininin sonraki inceleme 3,8 önce 30 dakika boyunca ortam içinde yeniden süspansiyon haline oksijenli kurtarmak için izin verin. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Ex vivo kültür Bunun yanı sıra, ekzokrin salgılanmasının çalışma için alternatif düzenleri pankreatik kanal sıvıların İntra vital mikroskopik ve hesaplanmasıdır. Intravital mikroskopi tükürük bezleri 10 fare iyi faaliyet gösterilmiştir. Bu yöntem, hayvanda, gerçek zamanlı olarak salgılanmasını kaydedebilir, ama çözünürlük ve ekzokrin doku işlenmesi için aracı ile sınırlıdır. Pankreatik kanala sıvıları toplayarak salgılanmasının değerlendirilmesi, aneste...

Ekzokrin pankreas, memeli pankreas kütlesinin çoğunu oluşturur ve sindirim enzimleri 1 üretimi ve salgılanması için adanmış. Ekzokrin pankreas, acinus, fonksiyonel birim ortak bir lümen oluşturur ve hisse epitel hücrelerinin bir küme. Hormonal veya nöronal uyarım üzerine, enzim ile dolu keseler bununla birlikte apikal hücre yüzeyine taşınan sigorta ve lümen içine 1-3 içeriğini çıkarmak. Salgılanan enzimler daha sonra besin, besin parçalanmasını katalize ince bağırsağa kanalların bir birleştirme grubu tarafından drene edilir. Bu video tüm pankreas izole edilir ve kendi salgılama kapasitesi ne kadar nasıl tespit edilebilir sağlam acininin gösterir. Bu kurulumu kullanılarak, pankreas salgı uyarılmasını takip yayımlanan amilaz nispi miktarının ölçülmesi ile ölçülür. Seçenek olarak ise, farklı salgılama kullanılmasıyla canlı görüntülenebilirsensörleri ve boyalar. Sağlam pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle edilen ve hayvanın tamamı 4-6 daha kolay kontrol edilebilir yana pankreas asinüs ex vivo olarak ayar avantajlıdır. Bu kurulum aslında 1970 sonlarında geliştirilen ve bu tükrük ve meme bezlerinin 3-7 gibi çeşitli ekzokrin dokuların çalışma için genişletilmiş beri oldu. Özellikle, bu polarize epitel kompleks hücresel kuruluşlara en az bir girişim ile salgılanmasının çalışma sağlar.

<table><tbody><tr><td>ICR mice</td><td>Harlan</td><td></td><td>Any strain will do</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264</td><td>Can substitude for KRB</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Fraction V</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>70-100&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Amylase infinity reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>TR25421</td><td></td></tr><tr><td>CCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2175</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Lifetechnologies</td><td>F34653</td><td>Diluted to 16&amp;micro;M</td></tr><tr><td>20mL scintillation vial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision system&amp;nbsp;</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td></tr><tr><td>Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>ELx808</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Pankreas asiner hücreler üretmek ve sindirim enzimleri salgılar. Bu hücreler ortak bir lümen oluşturur ve hisseleri bir küme olarak organize edilmektedir. Bu çalışma, bu hücrelerin izole edilmiş salgılama kapasitesi asini kültürü ile değerlendirilebilmektedir gösterilmiştir. Dokunulmamış ekzokrin pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle ve tüm hayvanda daha kolay kontrol edilebilir, çünkü kurulum avantajlıdır. Ex vivo kültür asini in vivo doğayı temsil edecek şekilde pankreas asini şekilde tecrit önemli bir gerekliliktir. Protokol fare pankreas sağlam asinüsü izole etmek için nasıl gösterir. Daha sonra, pankreas salgısını değerlendirmek için iki yardımcı yöntem sunulmaktadır. Pankreas salgılarının doğrudan görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar ise amilaz salgılanması deneyi, küresel bir tedbir olarak hizmet vermektedir. Toplu olarak, bu teknikler presented burada ekzokrin salgısını incelemek için deneyler geniş bir yelpazede sağlar.

Iletilen ışık ile bakıldığında düzgün izole edilmiştir Pankreas acininin klişeleşmiş bir morfolojiye sahiptir. Onların Bazolateral etki yuvarlak ve kabarcıkların yoksun görünmelidir. Apikal etki salgı veziküllerinde yüzlerce çevrili ve renk (Şekil 2A, B) koyu görünür. Çekirdekler veziküler alanına bazal yer almaktadır. Hücre kalıntısı ve pankreatik kanal sistemi ve acininin izolasyonu (Şekil 2C, D) erken aşamalarında tespit edilebilir endokrin pankre...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir.

, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

assessing-the-secretory-capacity-of-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science.  İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir. 

Video: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Kanser Araştırmaları

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Tıp

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

Biyomühendislik

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biyoloji

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İntraperitoneal İlaç Enjeksiyonu ile Farelerde Pankreas Hasarına İndükleme

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological changes associated with SAP using animal models can aid in identifying potential therapeutic targets and exploring novel treatment approaches. Previous studies primarily induced pancreatic injury through retrograde bile duct injection of sodium taviaurocholate, but the impact of surgical damage on the quality of the animal model remains unclear. In this study, we employed various frequencies of intraperitoneal Caerulein injections combined with different doses of LPS to induce pancreatic injury in C57BL/6J mice and compared the extent of injury across five intraperitoneal injection protocols. Regarding inducing acute pancreatitis in mice, an intraperitoneal injection protocol is proposed that results in a mortality rate as high as 80% within 5 days. Specifically, mice received ten daily intraperitoneal injections of Caerulein (50 &#181;g/kg), followed by an injection of LPS (15 mg/kg) one hour after the last Caerulein administration. By adjusting the frequency and dosage of injected medications, one can manipulate the severity of pancreatic injury effectively. This model exhibits strong controllability and has a short replication cycle, making it feasible for completion by a single researcher without requiring expensive equipment. It conveniently and accurately simulates key disease characteristics observed in human SAP while demonstrating a high degree of reproducibility.

Yazar Spotlight: Farelerde Şiddetli Akut Pankreatit için Yeni Tedaviler Geliştirmek için Terapötik Hedeflerin Belirlenmesi

Intraperitoneal drug administration is a safe and effective non-invasive approach for inducing pancreatic injury. This study compared five distinct intraperitoneal injection protocols on mice to induce varying degrees of pancreatic injury and established a model of severe pancreatic injury to investigate the pathological changes and treatment strategies for severe acute pancreatitis (SAP).

Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması

Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması

Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması