Bu çalışma BS ABD-İsrail BSF bir hibe ile finanse edildi ve EDSBS Moleküler Genetik Hilda ve Cecil Lewis profesörlük sandalyenin bir görevidir.

NOT: hayvan denekleri Prosedürleri Weizmann Bilim Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Pankreas asinüs izolasyonu <ol><li> Başlamadan önce taze Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) ortam 300 ml hazırlayın. 140 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 1.16 karıştırın mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 11 mM glikoz, 10 mM HEPES. Büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) (yeniden süspansiyon ortamı) ekleyin. Orta kollagenazının (~ 0.75 mg / ml) (sindirim ortamı) ile takviye edilmiş 10 ml yeniden süspansiyon - 5 hazırlayın. </li><li> ~ 30 dakika boyunca ortam KRB oksijenat. Köpüren önlemek için oksijenlenme sonra BSA ekleyin. 37 ° C resüspansiyon ve sindirim ortamlar getirin. NOT: orta Oksijenleyici hücre ölümlerini azaltır ve sekretagoglannın için yanıt geliştirir. Oksijenasyon etkisi en az 6 saat boyunca açıktır. </li><li&gt; kurumsal hayvan bakımı kurallarına göre, servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma fare Kurban. , Sırtında kurban hayvan koyun bir diseksiyon pad onu takın ve etanol ile karın yüzeyini temizleyin. NOT: kirlenmesini önlemek diseksiyon araçları ve kullanmadan önce KRBH ortamı için kullanılan suyun otoklavlamayın için. 0.2 um&#39;lik bir filtreden filtre ortamı KRBH. Önce pankreas çıkarılması için% 70 etanol ile diseksiyon araçları yıkayın ve temiz bir bankta diseksiyonu yürütmek. Seviye 3 biyo-güvenlik kabini viral enfeksiyonların yürütmek. O / N kültür ortamına antibiyotik ekleyin (Bölüm 4&#39;e bakınız). </li></ol></li><li> Murin pankreas eksizyonu <ol><li> Kesi yaygın karın deri ve deri altı tabaka. Karaciğer, mide, bağırsak, pankreas ve dalak (Şekil 1) tanımlayın. NOT: Aşağıdaki adımlarda, yavaşça pankreas dokusu işlemek ve aşırı mekanik FORC uygulamaktan kaçınıne doku ve hücre ölümüne otomatik sindirim önler. </li><li> İki künt forseps kullanarak, ince bağırsağa çekin. Mideden çıkışına yakın, ince barsak proksimal ucunda başlar. Bağırsaktan pankreas ayırın ve vücut boşluğunun içinde yerinde tutulması. Bir kez kalın bağırsağa ulaşan, pembe / beyaz bağ dokusu fark. Pankreas ile karıştırmayın. </li><li> Yağ veya bağ dokusu toplama olmadan mümkün olduğunca pankreas dokusu temizleyin. Dalak ve mide ayrılmakta ve karın kan damarları altındaki (Şekil 1A-C) keserek pankreas kaldırmak. NOT: Tek bir hayvandan alınan pankreas asinüs verimi yüksek olduğu için, bir başka dokular oluşmasını önlemek için tüm pankreas dokusu toplama kaçınırsan. </li></ol></li><li> Kolajenaz sindirimi <ol><li> Pankreas 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı yeniden süspansiyon ortamı içinde birkaç kez yıkayın ve pankreatik olmayan kalan bölümlerini kaldırmakdokular. Bir 20 mL sintilasyon şişesine önceden ısıtılmış bir sindirim ortamının ~ 5 ml pankreas bırakın. 1-3mm parçalarına pankreas kıyma. (Optimal olarak ~ 100 rpm çalkalama ile) ısıtılmış bir su banyosu içine koyun. Sindirim hızlandırmak için, sindirilmiş doku yukarı ve aşağı bir kez her birkaç dakikada bir pipetle. Not: kolajenaz sindirimi süresi esas olarak kolajenaz konsantrasyonu ve doku üzerinde uygulanan mekanik kuvvet miktarına bağlıdır. 30 hücre - 10 asinüs sonuçlanan 5 dak - 15 dakika boyunca, yaklaşık 0.75 mg / ml kollajenaz kullanımı ve 2 mm olan bir 5 ml&#39;lik pipet ile polistiren doku pipetle her 3 orifis. Sindirme işlemini takiben, süspansiyon doku görülebilir parçadan oluşan bulanık görüntülenir. Kalogenazlar verimleri farklı ticari tip ve sayıda arasında değişir bu yana, ampirik sindirim zamanlamasını belirler. </li><li> Yıkama ve filtreleme <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine sindirilmiş doku transferi ve kazı sonayeniden süspansiyon ortamı 45 ml ilave etmek suretiyle len. Bir kaba ile süspansiyon filtre (~ 1 mm), yeni bir tüpe, metal içine örgü. 3 dakika için akış yoluyla 100 × g santrifüj. </li><li> Süpernatant atılır ve yeniden süspansiyona alma ortamı, 50 ml dijeste pankreas yeniden süspanse edildi. 70 veya 100 mikron naylon örgü ile süspansiyon filtre. Önceki gibi santrifüj. </li><li> Resüspansiyon ortamın 5 ml -, yüzen, hasarlı asinüsü kaldırmak süpernatantı atmak ve 3 pankreas dokusu tekrar süspansiyon için. Yeniden süspansiyon ortamı 7 ml ile doldurulmuş 15 ml konik tüp içine pankreas asinüs 1 ml kısımlar uygulanır. 3 dakika - acininin 2 yerleşmek için izin verin. 1 ml&#39;lik bir pipet ile tüpün dibine yerleştirilmiş olan asinüsü toplamak ve bu adımı tekrar 2 - 3 defa. </li><li> Kendi durumunu test etmek için bir ışık veya diseksiyon mikroskobu altında pankreas asinüsü gör. Şekil 2&#39;de, İlginç tasarım hücreleri üzerinde açtığı izolasyon saflığını ve zararları gözlemlemekng izolasyon. Kadar 20 saat boyunca bu hemen asinüsü veya kültür kullanın. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Amilaz Salgı Testi Not: Amilaz salgılama tahlili pankreas asinüs salgılama kapasitesi için küresel bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Bu genellikle ticari bir kit kullanılarak, pankreas acininin inkübe edildiği ortamın toplanması, ve ortamın amilaz aktivitesinin belirlenmesi suretiyle elde edilir. <ol><li> Deneysel koşullar sayısının incelenecek belirlemek (örneğin, uyarılmamış genel uyarılmış). Her bir durum için en az üç suret kullanın. Buna ek olarak, ortam (&quot;sıfır&quot; örneği) amilaz aktivitesi için toplam hücresel amilaz içeriği (bakiyeleri örnek) ve bir kümesini belirlemek için replika kümesi ekleyin. Çok-çukurlu deney yapılacak olan plaka ve Her bir replika için mikro-tüpler iki takım etiketlemek kullanılır. NOT: 12 ya da 24 oyuklu plaka, sırasıyla, asinar süspansiyonlar 1 ve 0.5 ml izlemek için de kullanılabilir. </li><li> KRBH yeniden süspansiyon ortamı 30 ml iki kez asinüsü yıkayın ve 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca yeniden süspansiyon ortamı içine inkübe edin. Çok-çukurlu plaka için uygun nihai konsantrasyona ulaşmak için bir 10 ul salgılattırıcısı damla ekleyin. </li><li> Pankreas acininin çift fazlı bir şekilde salgılattırıcısı gradyanı yanıt. Kolesistokinin (CCK) ve 1 uM&#39;nin Karbakol&#39;ün (Şekil 3A), 100 uM 5 - uygun salgılama değerleri ile konsantrasyonları 50 bulunmaktadır. </li><li> Yıkama ortamı içinde yeniden süspansiyon ve asinüsü tekrar süspansiyon. Acininin çok kuyucuklu plaka içine ve &#39;total&#39; etiketli mikrotüpler içine süspansiyonun süspansiyon ve kısım eşit miktarlarda homojen olarak dağılmış olduğundan emin olun. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin. (Tercihen yumuşak çalkalama altında bir su banyosunda (~ 50 dak içinde)). NOT: asini tam sayısı experimen arasında değişebilirts her deneyde çoğaltır benzer olmalı ama. Bu nedenle, süspansiyonun tam acininin Alikotlama farklı tekrarlanmış ve koşullar arasında bir karşılaştırma için çok önemlidir. </li><li> İnkübasyon sırasında, &quot;toplam&quot; ve &quot;sıfır&quot; örneklerini üretmek. Santrifüj bakiyeleri 5000 x g &#39;de birkaç saniye mikrotüpler ve &quot;zero&#39; etiketli mikrotüpler içine süpernatandan 50 ul çıkarın ve 4 ° C&#39; de koyun. Mikro-tüplerin Lyse Triton X-100 eklenmesi ile bakiyeleri örnekleri acininin% 1 bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Kuvvetlice mikrotüpler vorteksleyin. NOT: &#39;Toplam&#39; deney çoğaltır benzer çoğaltır eşit olarak dağıtılır. Asinüsü parçalayan amilaz toplam içeriğinin açığa çıkmasına yol açar. Seçenek olarak ise, her deney hücresel içeriğini belirlemek için, deneyin sonunda, her bir durumda ve parçalanmasıyla de asinüsü toplanır. </li><li> Asiner süspansiyon i en toplayınönceden etiketlenmiş mikrotüplerde ilk kümesi Nto. 5.000 × g birkaç saniye boyunca mikrotüpler santrifüj. Önceden etiketlenmiş mikrotüpler ikinci sette içine süpernatant aktarın. </li><li> Ticari bir kit ile amilaz aktivitesi için yüzer maddeler sınama. Salgılanan amilaz yüzdesini hesaplayın. NOT: Bu lineer aralığında amilaz aktivitesini okumak için çok önemlidir. Ilk toplam içeriğine salınan amilaz yüzdesi olarak salgılanan amilaz yüzdesini sunulması. Her bir üç kopya medyumuyla arka plan düzeyi amilaz çıkarma ve benzer başlangıç ​​normalize edilmiş bir toplam muhtevası bölün. </li></ol> Pankreas Salgısının 3. Canlı Görüntüleme Pankreas asinüs salgılama, canlı görüntüleme ile doğrudan izlenebilir. Çeşitli floresan boyalar ve sensörlerini kullanarak, canlı görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar. <ol><li> Taze oksijenli resüspansiyon ortamı olarak hazırlayın in 1.1 adıma ve 37 ºC getirmek. Mikroskop ayarlayın ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmış ise, 37 ºC ayarlayın. </li><li> Yeniden süspansiyon ortamı 30 ml asinar hücreleri yıkayın ve bir cam ya da plastik slayt yerleştirin. Not: lipofilik boyalar, lipofilik boyalarla işaretlenmiş plazma zarı için etiket endositoz ile iç membran etiketleme önlemek için en fazla 5 dakika boyunca asinüsü leke için kullanılacak ise. Çalışma boyunca yavaşça asinüsü işlemek ve aşırı pipetleme kaçının. </li><li> Mikroskop kez at, kimin morfoloji görüntü acininin açıktır ve taban kabarcıklar ya da hücre içi vakuoller görüntülemek asini görüntüleme kaçının. Halinde ya da sırasında veya hemen önce görüntüleme başlamadan, ya bir perfüzyon odasına kullanılarak salgı damla ekleyin. NOT: Yüksek sayısal delikler ile yüksek büyütme lensler (örneğin × 63 / 1.4 veya 100 / 1.4 ×) hücre içi yapıları gözlemlemek için tavsiye edilir. </li></ol> 4. O / Pankreas asini N Kültürü (Alternatif Hücre Kültürü Tekniği) Not: O / N kültürlenmesi, genellikle adeno virüs enfeksiyonu için kullanılır. Tetkikten önce 16 saat - Enfeksiyon 9 10 6 -10 7 pfu / ml &#39;de gerçekleştirilir. <ol><li> En fazla 20 saat boyunca kültür pankreatik acininin. 25 ml kültür ortamı (DMEM tek pankreasından elde edilen yeniden süspansiyon haline acininin fetal buzağı serumu (FCS) (% 5), sodyum-piruvat (1%), antibiyotikler (% 1), L-glutamin (% 0.5), BSA ile desteklenmiş (10 mg / ml) ve STI (0.2 mg / ml) ve 10 cm plakalar beş ayrılmıştır. seviye 3 biyo-güvenlik kabininde virüs ile asinüsü Infect. </li><li> % 5 CO2 nemlendirilmiş hava içinde 37 ° C&#39;de pankreas asinüsü kuluçkalanmıştır. Acininin sonraki inceleme 3,8 önce 30 dakika boyunca ortam içinde yeniden süspansiyon haline oksijenli kurtarmak için izin verin. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Ex vivo kültür Bunun yanı sıra, ekzokrin salgılanmasının çalışma için alternatif düzenleri pankreatik kanal sıvıların İntra vital mikroskopik ve hesaplanmasıdır. Intravital mikroskopi tükürük bezleri 10 fare iyi faaliyet gösterilmiştir. Bu yöntem, hayvanda, gerçek zamanlı olarak salgılanmasını kaydedebilir, ama çözünürlük ve ekzokrin doku işlenmesi için aracı ile sınırlıdır. Pankreatik kanala sıvıları toplayarak salgılanmasının değerlendirilmesi, aneste...

Ekzokrin pankreas, memeli pankreas kütlesinin çoğunu oluşturur ve sindirim enzimleri 1 üretimi ve salgılanması için adanmış. Ekzokrin pankreas, acinus, fonksiyonel birim ortak bir lümen oluşturur ve hisse epitel hücrelerinin bir küme. Hormonal veya nöronal uyarım üzerine, enzim ile dolu keseler bununla birlikte apikal hücre yüzeyine taşınan sigorta ve lümen içine 1-3 içeriğini çıkarmak. Salgılanan enzimler daha sonra besin, besin parçalanmasını katalize ince bağırsağa kanalların bir birleştirme grubu tarafından drene edilir. Bu video tüm pankreas izole edilir ve kendi salgılama kapasitesi ne kadar nasıl tespit edilebilir sağlam acininin gösterir. Bu kurulumu kullanılarak, pankreas salgı uyarılmasını takip yayımlanan amilaz nispi miktarının ölçülmesi ile ölçülür. Seçenek olarak ise, farklı salgılama kullanılmasıyla canlı görüntülenebilirsensörleri ve boyalar. Sağlam pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle edilen ve hayvanın tamamı 4-6 daha kolay kontrol edilebilir yana pankreas asinüs ex vivo olarak ayar avantajlıdır. Bu kurulum aslında 1970 sonlarında geliştirilen ve bu tükrük ve meme bezlerinin 3-7 gibi çeşitli ekzokrin dokuların çalışma için genişletilmiş beri oldu. Özellikle, bu polarize epitel kompleks hücresel kuruluşlara en az bir girişim ile salgılanmasının çalışma sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Pankreas asiner hücreler üretmek ve sindirim enzimleri salgılar. Bu hücreler ortak bir lümen oluşturur ve hisseleri bir küme olarak organize edilmektedir. Bu çalışma, bu hücrelerin izole edilmiş salgılama kapasitesi asini kültürü ile değerlendirilebilmektedir gösterilmiştir. Dokunulmamış ekzokrin pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle ve tüm hayvanda daha kolay kontrol edilebilir, çünkü kurulum avantajlıdır. Ex vivo kültür asini in vivo doğayı temsil edecek şekilde pankreas asini şekilde tecrit önemli bir gerekliliktir. Protokol fare pankreas sağlam asinüsü izole etmek için nasıl gösterir. Daha sonra, pankreas salgısını değerlendirmek için iki yardımcı yöntem sunulmaktadır. Pankreas salgılarının doğrudan görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar ise amilaz salgılanması deneyi, küresel bir tedbir olarak hizmet vermektedir. Toplu olarak, bu teknikler presented burada ekzokrin salgısını incelemek için deneyler geniş bir yelpazede sağlar.

Iletilen ışık ile bakıldığında düzgün izole edilmiştir Pankreas acininin klişeleşmiş bir morfolojiye sahiptir. Onların Bazolateral etki yuvarlak ve kabarcıkların yoksun görünmelidir. Apikal etki salgı veziküllerinde yüzlerce çevrili ve renk (Şekil 2A, B) koyu görünür. Çekirdekler veziküler alanına bazal yer almaktadır. Hücre kalıntısı ve pankreatik kanal sistemi ve acininin izolasyonu (Şekil 2C, D) erken aşamalarında tespit edilebilir endokrin pankre...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir.

, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

assessing-the-secretory-capacity-of-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science.  İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir. 

Video: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biyoloji

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Fenotiplendirme Fare Solunum Fonksiyon<em&gt; İn Vivo</em&gt; Akciğer Yayıcı Kapasite

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

Mitokondrinin Termojenik Kapasitesini İncelemek için Yama-Kelepçe Tekniğinin Kullanımı

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Retina Pigment Epitelyal Fagositoz ve Lipofusin Birikiminin Ölçülmesi

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

Yazar Gündemi: Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofuscin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...