Name: assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells
Uploaded: 2014-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della BSF USA-Israele a BS e EDSBS è un incombente della cattedra Hilda e Cecil Lewis in Genetica Molecolare.

NOTA: Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso il Weizmann Institute of Science. Preparazione del campione 1 <ol><li> Isolamento di acini pancreatici <ol><li> Preparare 300 ml di fresca bicarbonato di Krebs-Ringer HEPES (KRBH) mezzo prima di iniziare. Mescolare 140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.16 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11 Glucosio mM, HEPES 10 mM. Aggiungi albumina sierica bovina (BSA) e / ml inibitore 0,1 mg di tripsina di soia (STI) (media risospensione). Preparare 5-10 ml di risospensione medie integrate con collagenasi (~ 0,75 mg / ml) (media digestione). </li><li> Ossigenare il terreno KRB per ~ 30 min. Aggiungi BSA dopo ossigenazione per evitare di bubbling. Portare risospensione e digestione medium a 37 ° C. NOTA: ossigenante medio riduce la mortalità delle cellule e migliora la risposta ai secretagoghi. L&#39;effetto di ossigenazione risulta almeno per 6 ore. </li><li&gt; sacrificare il mouse per dislocazione cervicale o di CO 2 asfissia, secondo le linee guida per la cura degli animali istituzionali. Posizionare l&#39;animale sacrificato sulla sua schiena, allegarlo a un pad dissezione e pulire la superficie addominale con etanolo. NOTA: Per evitare contaminazioni, sterilizzare in autoclave gli strumenti di dissezione e l&#39;acqua utilizzata per KRBH medio prima dell&#39;uso. Filtrare KRBH mezzo attraverso un filtro da 0,2 micron. Prima di asportazione del pancreas sciacquare gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo e procedere dissezione su un banco pulito. Effettuare infezioni virali in un armadio livello 3 bio-sicurezza. Aggiungi antibiotici per l&#39;/ N mezzo di coltura O (vedere paragrafo 4). </li></ol></li><li> L&#39;asportazione del pancreas murino <ol><li> Incisione ampiamente la cute addominale e lo strato sottocutaneo. Identificare il fegato, stomaco, intestino, pancreas e milza (Figura 1). NOTA: Nelle seguenti procedure, gestire il tessuto pancreatico delicatamente ed evitare l&#39;applicazione di un eccessivo forc meccanicae per evitare l&#39;auto-digestione della morte dei tessuti e delle cellule. </li><li> Utilizzando due pinze smussate, tirare fuori il piccolo intestino. Inizia la piccola estremità prossimale dell&#39;intestino, vicino all&#39;uscita dallo stomaco. Separare il pancreas dall&#39;intestino e conservarlo all&#39;interno della cavità del corpo. Una volta raggiunto l&#39;intestino crasso, notare un tessuto connettivo rosa / bianco. Da non confondere con il pancreas. </li><li> Svuota il tessuto pancreatico quanto possibile senza la raccolta tessuto adiposo o connettivo. Rimuovere il pancreas staccando dalla milza e lo stomaco e il taglio dei vasi sanguigni addominali sotto di esso (Figura 1A-C). NOTA: Poiché il rendimento di acini pancreatici da un singolo animale è elevato, si può astenersi dal raccogliere tutto il tessuto pancreatico per impedire la raccolta di altri tessuti. </li></ol></li><li> Collagenase digestione <ol><li> Sciacquare il pancreas un paio di volte in mezzo risospensione riscaldata a 37 ° C e rimuovere le rimanenti parti di non-pancreaticatessuti. Immergere il pancreas a ~ 5 ml di terreno digestione pre-riscaldato in un scintillazione flaconcino da 20 ml. Tritare il pancreas a pezzi di 1-3mm. Mettere in un bagno di acqua riscaldata (in modo ottimale sotto agitazione di ~ 100 rpm). Per accelerare la digestione, pipettare il tessuto digerito alto e verso il basso una volta ogni pochi minuti. NOTA: La durata della collagenasi digestione dipende principalmente dalla concentrazione collagenasi e dalla quantità di forza meccanica applicata sul tessuto. Uso di 0,75 mg / ml di collagenasi per circa 15 min e pipettaggio il tessuto con una pipetta da 5 ml in polistirolo con 2 mm foro di passaggio di ogni 3-5 minuti, con conseguente acini di 10-30 cellule. Dopo la digestione, la sospensione appare torbido, contenente frammenti visibili di tessuto. Dal Collagenasi efficienza varia tra i diversi tipi commerciali e lotti, determinare i tempi di digestione empiricamente. </li><li> Lavaggio e filtraggio <ol><li> Trasferire il tessuto digerito in una provetta da 50 ml e terminare digestion aggiungendo 45 ml di mezzo di risospensione. Filtrare la sospensione attraverso una grossolana (~ 1 mm) rete metallica in una nuova provetta. Centrifugare la flow-through a 100 × g per 3 min. </li><li> Eliminare il surnatante e risospeso il pancreas digeriti in 50 ml di mezzo di risospensione. Filtrare la sospensione attraverso una maglia di nylon 70 o 100 micron. Centrifugare come prima. </li><li> Al fine di rimuovere galleggiante, acini danneggiati, scartare il surnatante e risospendere il tessuto pancreatico in 3 - 5 ml di mezzo di risospensione. Applicare 1 ml di acini pancreatici in 15 ml provette coniche riempiti con 7 ml di terreno risospensione. Lasciare che il acini di stabilirsi per 2 - 3 min. Raccogliere la acini che si sono stabiliti sul fondo della provetta con una pipetta 1 ml, e ripetere questo passaggio 2 - 3 volte. </li><li> Visualizza il acini pancreas al microscopio ottico o dissezione per testare la loro condizione. Nella figura 2, osservare la purezza di isolamento e danni inflitti alle cellule Duriisolamento ng. Utilizzare questi acini immediatamente o cultura per un massimo di 20 ore. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 Amilasi secrezione Assay NOTA: Il test secrezione di amilasi serve come misura globale per la capacità secretoria di acini pancreatici. Ciò si ottiene raccogliendo il mezzo in cui gli acini pancreatici sono stati incubati, e determinando l&#39;attività dell&#39;amilasi del mezzo, in generale mediante un kit commerciale. <ol><li> Determinare il numero di condizioni sperimentali da esaminare (ad esempio vs non-stimolata stimolato). Utilizzare almeno tre repliche per ogni condizione. Inoltre, aggiungere un set di repliche per determinare il contenuto totale cellulare amilasi (campione &#39;totale&#39;) e un set per l&#39;attività amilasi del medium (campione di &#39;zero&#39;). Etichettare una piastra multi-pozzetto in cui sarà condotta l&#39;analisi, e due serie di microtubi per ciascuna delle repliche da utilizzare. NOTA: a 12 o 24 pozzettis può essere utilizzato per monitorare 1 e 0,5 ml di sospensioni acinose, rispettivamente. </li><li> Lavare la acini due volte in 30 ml di KRBH media di risospensione e incubare in mezzo risospensione per 30 minuti a 37 ° C. Per la piastra multi-bene aggiungere una goccia 10μl di secretagogue per raggiungere la concentrazione finale appropriato. </li><li> Acini pancreatici rispondono a un gradiente di secretagogo in maniera bi-fasica. Le concentrazioni con valori ottimali di secrezione sono 50 - 100 pM di colecistochinina (CCK) e 1μM di Carbachol (figura 3A) 5. </li><li> Lavare e risospendere il acini in mezzo risospensione. Assicurarsi che le acini sono distribuiti in modo omogeneo nelle sospensioni e aliquote uguali quantità di sospensione nella piastra multi-bene e nei &#39;microtubi total&#39; marcato. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C. (Preferibilmente in un bagno di acqua sotto agitazione lieve (~ 50 min)). NOTA: Il numero esatto di acini può variare tra sperits ma dovrebbero essere simili in replicati all&#39;interno di ogni esperimento. Così, la suddivisione in aliquote precisa della sospensione acini è fondamentale per il confronto tra le diverse repliche e condizioni. </li><li> Durante l&#39;incubazione, produrre il &#39;totale&#39; e campioni &quot;zero&quot;. Centrifugare le microprovette &quot;totale&quot; per pochi secondi a 5000 × g e rimuovere 50 microlitri dal surnatante in &#39;microtubi zero&#39;-etichettati e metterli a 4 ° C. Lyse acini nei campioni &quot;totale&quot; con l&#39;aggiunta di Triton X-100 per le microprovette per raggiungere una concentrazione finale di 1%. Agitare vigorosamente le microprovette. NOTA: Aliquote il &#39;totale&#39; replica simile alle repliche dell&#39;esperimento. Lisi delle acini, porta al rilascio del tenore totale di amilasi. In alternativa, raccogliere gli acini in ogni condizione e lisi, alla fine dell&#39;esperimento, per determinare il contenuto cellulare di ogni replica. </li><li> Raccogliere la maggior parte della sospensione acinare into la prima serie di microtubi pre-etichettati. Centrifugare le microprovette per pochi secondi a 5.000 × g. Trasferire il surnatante nella seconda serie dei microtubi pre-etichettati. </li><li> Analizzare il surnatante per l&#39;attività amilasica con un kit commerciale. Calcolare la percentuale di amilasi secreta. NOTA: E &#39;fondamentale leggere l&#39;attività amilasica alla sua gamma lineare. Presentare la percentuale di amilasi secreta come la percentuale di amilasi liberato dal contenuto totale iniziale. Sottrarre il livello di fondo amilasi del mezzo da ogni triplice copia e dividerlo per il contenuto totale iniziale simile normalizzata. </li></ol> 3 Immagini dal vivo della secrezione pancreatica La secrezione da acini pancreatici può essere monitorato direttamente da immagini dal vivo. Utilizzando vari coloranti fluorescenti e sensori, imaging dal vivo permette la caratterizzazione di secrezione ad una risoluzione sub-cellulare. <ol><li> Preparare medio risospensione appena ossigenato come in punto 1.1 e portare a 37 ° C. Impostare il microscopio, e se dotato di un regolatore di temperatura, regolare a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule acinose in 30 ml di terreno di risospensione e metterli in un vetro o di plastica diapositiva. Nota: Se coloranti lipofili devono essere utilizzati per etichettare Per membrana plasmatica etichettati con coloranti lipofili, macchiare la acini per non più di 5 minuti per evitare l&#39;etichettatura delle membrane interne per endocitosi. Durante il lavoro, gestire la acini dolcemente ed evitare un&#39;eccessiva pipettaggio. </li><li> Una volta al microscopio, acini immagine la cui morfologia è chiara, ed evitare l&#39;imaging di acini che visualizzano vesciche basolaterale o vacuoli intracellulari. Aggiungi secretagogue goccia a goccia o utilizzando una camera di perfusione, durante o immediatamente prima dell&#39;inizio di imaging. NOTA: A lenti ad alto ingrandimento con alte aperture numeriche (ad esempio x 63 / 1,4 o × 100 / 1.4) si raccomanda di osservare le strutture subcellulari. </li></ol> 4. O / N Cultura del pancreas Acini (cellulare Alternate Cultura Tecnica) NOTA: O / N coltura viene spesso utilizzato per l&#39;infezione da virus adeno. L&#39;infezione viene condotta a 10 6 -10 7 pfu / ml per 9 - 16 ore prima dell&#39;esame. <ol><li> Cultura acini pancreatici per un massimo di 20 ore. Acini risospese ottenuto da un unico pancreas in 25 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con siero fetale di vitello (FCS) (5%), sodio piruvato (1%), antibiotici (1%), L-glutammina (0,5%), BSA (10 mg / ml) e STI (0,2 mg / ml), e diviso per cinque piastre 10 centimetri. Infect acini con virus in un armadietto livello 3 biosicurezza. </li><li> Incubate acini pancreatici a 37 ° C in aria umidificata 5% di CO 2. Consenti acini di recuperare in media risospensione ossigenato per 30 minuti prima di successivo esame 3,8. </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Oltre alla cultura ex vivo, configurazioni alternative per lo studio della secrezione esocrina includono la microscopia intravitale e la misurazione di fluidi dal dotto pancreatico. Microscopia intravitale ha dimostrato di operare bene nel topo ghiandole salivari 10. Questo metodo può registrare la secrezione in tempo reale nel intatta di un animale, ma è limitato nella sua risoluzione e dai mezzi per manipolare il tessuto esocrino. Valutare la secrezione attraverso la raccolta di fluidi dal dotto ...

Il pancreas esocrino costituisce la maggior parte della massa del pancreas mammiferi ed è dedicata alla produzione e secrezione di enzimi digestivi 1. L&#39;unità funzionale del pancreas esocrino, l&#39;acino, è un ammasso di cellule epiteliali che formano e condivide un lume congiunta. Dopo stimolazione ormonale o neuronale, vescicole piene di enzimi vengono trasportati alla superficie della cellula apicale, si fondono con esso ed espellono il loro contenuto nel lume 1-3. Gli enzimi secreti vengono poi svuotati da una serie coalescenza di condotti nel piccolo intestino, dove si catalizzano la ripartizione del cibo in sostanze nutritive. Questo video dimostra come acini intatti sono isolate dal pancreas intero e come la loro capacità secretoria può essere valutata. Utilizzando questa impostazione, la secrezione pancreatica viene quantificato misurando la quantità relativa di amilasi che è stato rilasciato dopo stimolazione. In alternativa, la secrezione può essere realizzata live dall&#39;uso di differentisensori e coloranti. L&#39;ex vivo installazione di acini pancreatici è vantaggiosa in quanto acini isolato, che conservano molte caratteristiche del pancreas intatti, può essere manipolata e controllata più facilmente che in tutta animali 4-6. Questa configurazione è stato originariamente sviluppato alla fine degli anni 1970 ed è stato dato prorogato per lo studio di diversi tessuti esocrine, come salivari e ghiandole mammarie 3-7. In particolare, consente lo studio della secrezione con la minima interferenza alle complesse organizzazioni cellulari di questi epiteli polarizzati.

<table><tbody><tr><td>ICR mice</td><td>Harlan</td><td></td><td>Any strain will do</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264</td><td>Can substitude for KRB</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Fraction V</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>70-100&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Amylase infinity reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>TR25421</td><td></td></tr><tr><td>CCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2175</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Lifetechnologies</td><td>F34653</td><td>Diluted to 16&amp;micro;M</td></tr><tr><td>20mL scintillation vial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision system&amp;nbsp;</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td></tr><tr><td>Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>ELx808</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Cellule acinose pancreatiche producono e secernono enzimi digestivi. Queste cellule sono organizzate come un gruppo che forma e condivide un lume congiunta. Questo lavoro dimostra come la capacità secretoria di queste cellule può essere valutata mediante coltura di isolati acini. La configurazione è vantaggiosa in quanto acini isolato, che conservano molte caratteristiche del pancreas esocrino intatto può essere manipolata e controllata più facilmente che in tutta animali. Isolamento corretto di acini pancreas è un requisito chiave in modo che la cultura ex vivo rappresenterà la natura in vivo degli acini. Il protocollo dimostra come isolare acini intatti dal pancreas del mouse. Successivamente, due metodi complementari per la valutazione della secrezione pancreatica sono presentati. Il dosaggio secrezione dell&#39;amilasi serve come misura globale, mentre l&#39;imaging diretto della secrezione pancreatica permette la caratterizzazione della secrezione ad una risoluzione sub-cellulare. Collettivamente, le tecniche Presented qui consentono un ampio spettro di esperimenti per studiare la secrezione esocrina.

Acini pancreas che sono stati isolati correttamente visualizzare una morfologia stereotipata se visti da luce trasmessa. I loro domini basolaterali dovrebbero apparire rotondo e privo di vesciche. Il dominio apicale è circondato da centinaia di vescicole secretorie e appare di colore più scuro (Figura 2A, B). I nuclei sono situati basale alla zona vescicolare. Detriti cellulari e componenti del sistema duttale del pancreas e del pancreas endocrino, che può essere rilevato nelle fasi iniziali di acini...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolato acini pancreatici mantengono la loro morfologia e l&#39;attività in vivo ed offrono modi potenti per il controllo e la manipolazione della secrezione. Questo lavoro dimostra come acini possono essere isolate dal pancreas del mouse, e come le loro capacità di secrezione possono essere valutati.

Valutare la capacità secretoria delle cellule pancreatiche acinari

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Views.  Weizmann Institute of Science.  Isolato acini pancreatici mantengono la loro morfologia e l'attività in vivo ed offrono modi potenti per il controllo e la manipolazione della secrezione. Questo lavoro dimostra come acini possono essere isolate dal pancreas del mouse, e come le loro capacità di secrezione possono essere valutati. 

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Analisi co-coltura delle interazioni proteina extracellulare che influenzano secrezione di insulina da parte del pancreas cellule beta

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Medicina

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

Bioingegneria

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologia e infezioni

Induzione di lesioni pancreatiche nei topi attraverso l'iniezione intraperitoneale di farmaci

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological changes associated with SAP using animal models can aid in identifying potential therapeutic targets and exploring novel treatment approaches. Previous studies primarily induced pancreatic injury through retrograde bile duct injection of sodium taviaurocholate, but the impact of surgical damage on the quality of the animal model remains unclear. In this study, we employed various frequencies of intraperitoneal Caerulein injections combined with different doses of LPS to induce pancreatic injury in C57BL/6J mice and compared the extent of injury across five intraperitoneal injection protocols. Regarding inducing acute pancreatitis in mice, an intraperitoneal injection protocol is proposed that results in a mortality rate as high as 80% within 5 days. Specifically, mice received ten daily intraperitoneal injections of Caerulein (50 &#181;g/kg), followed by an injection of LPS (15 mg/kg) one hour after the last Caerulein administration. By adjusting the frequency and dosage of injected medications, one can manipulate the severity of pancreatic injury effectively. This model exhibits strong controllability and has a short replication cycle, making it feasible for completion by a single researcher without requiring expensive equipment. It conveniently and accurately simulates key disease characteristics observed in human SAP while demonstrating a high degree of reproducibility.

Autore in primo piano: Identificazione dei bersagli terapeutici per lo sviluppo di nuovi trattamenti per la pancreatite acuta grave nei topi

Intraperitoneal drug administration is a safe and effective non-invasive approach for inducing pancreatic injury. This study compared five distinct intraperitoneal injection protocols on mice to induce varying degrees of pancreatic injury and established a model of severe pancreatic injury to investigate the pathological changes and treatment strategies for severe acute pancreatitis (SAP).

Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

Valutare la capacità secretoria delle cellule pancreatiche acinari

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

Analisi co-coltura delle interazioni proteina extracellulare che influenzano secrezione di insulina da parte del pancreas cellule beta

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride

Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride

Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride