This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntese Nota: dfTAT é produzida em duas etapas: a síntese do monómero fTAT por síntese de péptidos em fase sólida, seguido por dimerização de dissulfureto para formar dfTAT ligação. <ol><li> Ondas 500 mg de resina MBHA-Amida Rink em dimetilformamida (DMF) em 50 ml de uma embarcação SPPS padrão durante 1 h. </li><li> Realizar Fmoc desprotecção através da incubação da resina protegido com Fmoc numa solução de piperidina a 20% (20% de piperidina em DMF, 10 ml (0,30 mmol). Levar a cabo passos de desprotecção duas vezes (1 x 5 minutos e 1 x 15 min), com um passo de lavagem utilizando DMF (o passo de lavagem inclui a lavagem da resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF e a remoção do solvente por filtração sob vácuo) em entre reacções. </li><li> Sintetizar CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) na resina MBHA rink amida. Usar o seguinte aminoácidos protegidos com Fmoc: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (apenas no terminal N), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys e (Trt) -OH. Efectua-se a reacção utilizando N 2 (20 psi) a agitar a reacção. Executar todas as reacções no RT. <ol><li> Levar a cabo cada uma das reacções de acoplamento de aminoácidos, durante 4 h. Para cada acoplamento, utilizar o aminoácido protegido com Fmoc (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-il) urónio hexafluorofosfato (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), e diisopropiletilamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) dissolvido em DMF. A seguir ao acoplamento de 4 h, lavar a resina com DMF e realizar o passo de desprotecção de Fmoc como descrito no passo 1.2. </li><li> Repita até a cadeia peptídica linear de fTAT (cadeia peptídica linear: CKRKKRRQRRRG não TMR) foi sintetizado. </li><li> Em seguida, lave resina, cuidadosamente, com primeiro DMF e seguindo que com diclorometano (DCM). Lavar a resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF ou DCM e remover o solvente por filtração sob vácuo. </li><li> VCSE MALDI-TOF para confirmar que o péptido obtido tem o peso molecular correcto. <ol><li> Adicione uma mistura matriz por adição de 1 mg de matriz a uma solução composta por 50 ul de TFA a 0,01% em solução de água e 50 ul de acetonitrilo. </li><li> Para confirmar massa cadeia de péptido linear, utilizar ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. Executar uma HPLC analítica do péptido bruto e recolher 50 ul a partir do topo do pico puro. </li><li> Para preparar a amostra para a chapa na placa de MALDI: Adicionar 8 ul de péptido a 2 ul de solução de matriz e o lugar sobre a placa de MALDI para o ar seco ou numa coluna C de calor de placas 37 °. Nota: A arginina é conhecido por ser um ácido difícil par SPPS amino. Acoplamento bem sucedido é estabelecida através da realização de um teste de Kaiser 14 (por exemplo, teste, teste da ninidrina). Este ensaio permite a detecção de aminas livres que ainda possam estar desacoplado na resina. No caso de uma coloração azul detectado (indicativo da presença de aminas livres), de acoplamento sPTE são repetidos. </li></ol></li></ol></li><li> Para CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), clivar o grupo protector para o grupo Mtt -amino de Lys na CK (-NH-MTT) TATG com uma solução composta por 1% de ácido trifluoroacético (TFA) e triisopropilsilano 2% (TIS) em DCM. <ol><li> Como a remoção do grupo protector de MTT iria resultar no aparecimento de uma cor amarela, incubar a resina com 20 ml da solução acima durante 5 min, repetir este processo até não se observar a cor amarela. Lava-se a resina com DCM e DMF no meio. Além disso, uma vez TIS é um necrófago que limpam o MTT, uma vez que nenhuma cor amarela aparece na solução na presença de MTT. </li><li> Adicionar uma solução adicional com 1% de TFA em DCM (sem TIS) à resina para assegurar que nenhum mais MTT é removido e a solução permanece límpida. </li></ol></li><li> Dissolver as três componentes: carboxitetrametilrodamina (TMR), HBTU, e DIEA (4, 3,9 e 10 equivalência em relação à quantidade de resina (em mg)) em DMF e adicione essa misturapara a resina e realizar a reacção de O / N usando N2 seco para proporcionar agitação. </li><li> Após desprotecção de Fmoc-aminoácido e de conjugação, lavar a resina com DCM e deixar secar. Por clivagem completa do péptido da resina, adicionar uma solução contendo 92,5% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5%, TIS, e 2,5% de etanoditiol (EDT) (volume total = 4 ml) para a peptidil-resina durante 3 horas à temperatura ambiente para alcançar a desprotecção global e a clivagem a partir da resina. <ol><li> Precipitar o produto peptídeo bruto usando éter etílico anidro frio (Et2O) por drenagem da solução a partir do passo 1.6 em 40 mL de Et2O, esta rodada para baixo a 4 ° C e 4000 g durante 20 - 25 min. Repetir esta etapa para permitir a lavagem do precipitado com anidro frio Et2O </li><li> Ressuspender os precipitados em água (5 ml ou até precipitado é completamente dissolvido) e liofilizar. Em seguida ressuspender os produtos obtidos em 0,1% de TFA aquoso / acetonitrilo. </li></ol></li> &lt;li&gt; Realizar a análise por HPLC com uma coluna analítica C18 (5 uM, 4 x 150 mm) para analisar cada péptido. Usar uma taxa de fluxo de 1 mL / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. </li><li> Realizar HPLC semi-preparativa numa coluna C18 de 10 x 250 mm para a purificação de péptidos. Utilize uma taxa de fluxo de 4 ml / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. Para todas as corridas, utilizar gradientes lineares de 0,1% de TFA aquoso (solvente A) e 90% de acetonitrilo, 9,9% de água, e 0,1% de TFA (solvente B). </li><li> Confirmar a identidade correta dos peptídeos por MALDI-TOF de acordo com o protocolo do fabricante: fTAT, massa esperada: 2,041.17, massa observada: 2.040,66. DEAC-K9, massa esperada: 1,412.97, observou massa: 1,415.59. Usar uma matriz α- ácido ciano-4-hidroxicinâmico para a MALDI-TOF. </li></ol> 2. reacção de oxidação: Geração dfTAT <ol><li> Arejar salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4, durante 1 hora (a menos de 5 ml para a reacção abaixo). </li><li> Dissolver fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) em aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Certifique-se de que o pH é entre 7,0 - 7,5, após a adição do péptido. Se não adiciona-se hidróxido de sódio (1 M, em incrementos pequenos 1 - 5 ul) para levar o pH para trás até 7,4. </li><li> Nota: O oxigénio dissolvido em PBS age para oxidar os grupos tiol em fTAT e formar uma ligação dissulfureto. </li><li> Nutar a reacção S / N para permitir que ele reaja até à conclusão (rendimento 100% com base na análise por HPLC). Purifica-se o produto usando HPLC de fase reversa e análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF) tal como no passo 1.9. Massa esperada: 4,080.34, observou massa: 4,084.21. </li><li> Liofilizar puro dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) e ressuspender em 200 mL de água (concentração pura dfTAT = 356,3 M). </li></ol> 3. Medindo dfTAT Concentração <ol><li> Ressuspender numa alíquota da dfTAT purificada (tipicamente 1 ul, dependendo da quantidade de péptido purificado) em 149 ul de uma solução 50 mM de TCEP. </li><li> Nota: Nesta etapa dfTAT é reduzido ao seu monomer homólogo fTAT para eliminar a absorção de têmpera que ocorre devido à proximidade do fluoróforo TMR em dfTAT (ε o coeficiente de extinção de TMR em dfTAT é reduzido em comparação com o ε da TMR em redução fTAT). </li><li> Deixar a amostra reagir durante aproximadamente 20 min (HPLC analítica pode ser usado para confirmar a formação de fTAT). </li><li> Adicionar toda a solução para a cuvete de quartzo e medir a absorvância a 556 nm. </li><li> Usando a lei de Beer (A = εcl: ε = 91.500 M-1 cm-1) para calcular a concentração de fTAT, determinar a concentração de dfTAT, e dividir [fTAT] por dois. </li></ol> 4. Experimentos administração celular <ol><li> Semente as células (HeLa, HDF, etc.) Em um prato de cada confluência de 80 - 90% (por exemplo, de 8 poços ou 24 poços prato). Cultivar células em um meio apropriado (por exemplo, DMEM suplementado com FBS a 10% e Pen / Strep) até 80 - 90% de confluência em uma temperatura de 37 ° Catmosfera humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células três vezes (3x) com PBS (através da adição de 200 ul de PBS e, em seguida, removendo-o três vezes). </li><li> Adicione uma concentração de trabalho de 5 uM dfTAT por diluição de um stock de dfTAT (em água) em NRL-15 media (por um prato 8 bem o volume total deve ser de 200 uL). Uma concentração de 5 uM dfTAT leva a entrega eficaz (nível elevado de entrega citosólico em mais de 90% das células presentes num prato) na maioria dos tipos celulares testados até à data (Figura 3). No entanto, concentrações mais altas ou mais baixas podem ser mais adequadas para os tipos de células com uma propensão elevada ou baixa para a penetração. NOTA sobre Media: NRL-15 é usado para a entrega de dfTAT uma vez que não contêm cisteína que poderia reduzir a ligação di-sulfito em dfTAT. No entanto, os nossos dados indicam que tanto normal G-15 (com cisteína) e DMEM podem ser utilizados como os meios de entrega. G-15 contém o aminoácido cisteína mas reduzindo presumab cisteínaly oxida na mídia para formar cistina (DMEM é formulado com cistina). Por conseguinte, permanece intacta dfTAT nestes meios de entrega e funciona com a mesma eficiência que o obtido com nrL15. </li><li> Incubar as células com dfTAT (5 ^ M) com ou sem carga (por exemplo., EGFP (10 uM)) e manter a 37 ° C durante 1 h (tempo de incubação pode ser reduzido, mas dfTAT tipicamente requer cerca de 30 a 45 min para induzir fuga de endossomal ). </li><li> Lavar as células com heparina (1 mg / ml) em L-15 (3 lavagens são recomendados) para remover dfTAT ligado à membrana plasmática das células. </li><li> Incubar as células com células-impermeável corante nuclear, por exemplo., Sytox azul, Sytox verde (2 uM em NRL-15), para determinar se a membrana do plasma de células está comprometida (células mortas serão coradas enquanto que as células vivas não vai) de acordo com a o protocolo do fabricante. </li><li> Células de imagem utilizando um microscópio de fluorescência (imersão em óleo de 100X ou objetiva 20X). DfTAT imagem utilizando um filtro de RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Nota: a entrega bem sucedida leva a uma fluorescência difusa dfTAT de toda a célula (avaliação da entrega da proteína ou do péptido de interesse vai depender da aplicação). A coloração dos nucléolos por fTAT (o produto reduzido a partir da entrada de dfTAT citosólica) pode ser utilizada como uma indicação de que a fluorescência é detectada intracelular. fTAT irá degradar dentro de poucas horas. Neste ponto, a fluorescência dos fragmentos de degradação aparece como ponteada. Isso não deve ser confundido com a distribuição pontuada que também é visto se dfTAT permanece sem sucesso preso dentro endosomes (isso pode acontecer se dfTAT está presente em muito baixo de uma concentração). </li></ol> 5. Controling Concentração de MOI Proferido <ol><li> Identificar a concentração de &quot;entrega ideal&quot; necessária para conseguir uma libertação eficaz do citosólica dfTAT no tipo de células utilizado. Realizar a microscopia de fluorescência de células incubadas com increasinconcentrações g de dfTAT. A concentração óptima dfTAT é definida como a concentração mínima que leva para limpar citosólica &quot;difusa&quot; TMR fluorescência em aproximadamente 100% das células em cultura. </li><li> Variar a concentração de MOI utilizado no protocolo de co-incubação, mantendo constante a concentração de dfTAT (por exemplo, usando entrega concentração óptima de dfTAT). Alterando o tempo de incubação para menos do que 1 hora pode também ser uma opção para variar a quantidade de MOI entregue. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

As células utilizadas para entrega dfTAT não deve ser excessivamente confluente (&gt; 90% de confluência) pois isso pode afetar a eficiência de entrega. As células devem também ser saudável: células mortas na cultura podem libertar fragmentos apoptóticos com as quais pode interagir dfTAT (por exemplo, ADN de núcleos degradados). Este por sua vez, pode interferir com a eficiência de entrega e a qualidade de imagem. As células devem ser lavadas cuidadosamente para remover FBS antes de adicionar dfTAT....

A administração de proteínas, péptidos ou pequenas moléculas celulares impermeável em células vivas é muitas vezes desejável em muitas aplicações biológicas ou biotecnológicos (imagiologia celular, ensaios funcionais, de reprogramação celular, etc.) 1-4. Muitas abordagens de entrega já foram relatados, incluindo microinjecção, electroporação, ou a utilização de agentes veiculares (por exemplo., Péptidos de penetração de células, tais como tat, lípidos) 5-7. Cada técnica tipicamente tem prós e contras específicos que podem fazer essas abordagens adequadas para certas aplicações, mas não para outros. Problemas comuns envolvem a eficiência de entrega pobres e / ou falta de controle de quanto material é fornecido 8,9, toxicidade ou impacto fisiológico deletério 10,11, a falta de controle temporal, entrega em algumas células, mas não em toda a população (por exemplo., microinjecção) 12, e complexo de conjugação química ou formulação esquemas 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Recentemente, temos desenvolvido uma estratégia de entrega de romance que contorna essas limitações. Esta estratégia baseia-se em um peptídeo chamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) 13. dfTAT é derivado a partir do bem conhecido péptido célula-penetrante (CPP) TAT. dfTAT contém duas cópias dissulfureto ligado de TAT marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Apesar de suas semelhanças, TAT e dfTAT diferem significativamente em atividade. TAT é tipicamente internalizado nas células por endocitose. Este CPP permanece no entanto principalmente preso dentro endosomes (isto geralmente levam a uma distribuição pontuada do peptídeo no interior das células, quando examinado por microscopia de fluorescência). Como TAT, dfTAT é eficientemente endocitose pelas células. No entanto, dfTAT não fica preso dentro endosomes. Em vez disso, ela medeia endossomal vazamento de uma maneira que é extremamente eficiente. A actividade de dfTAT endosomolytic pode então ser explorada para entregar macromoléculas através de um ensaio de incubação simples. ntent &quot;&gt; O entendimento actual do processo de entrega é como se segue. dfTAT induz macropinocitose. Como resultado, as células incubadas com dfTAT tomar-se as proteínas solúveis, péptidos ou pequenas moléculas (moléculas de interesse, MOI) presentes nos meios de comunicação por fluido-fase endocitose (ver Figura 1). As interacções entre dfTAT e MOI não são necessários, desde que o tráfego de entidades, em conjunto dentro da via endocítica. Como dfTAT atinge um certo limite dentro do lúmen de organelos endocíticas, que expressa a sua actividade vazamento endossomal (os detalhes moleculares continuam a ser completamente caracterizados). O conteúdo do lúmen dos organelos gotejantes, e, por conseguinte, a MOI, é então libertado para dentro das células. Esta abordagem é, por conseguinte, muito conveniente como não há de conjugação ou formulação regimes com MOI são requeridas. Além disso, porque dfTAT é não modificar directamente uma MOI, que também não deve interferir com a função MOIs uma vez entrega intracelular é alcançada. Além disso, a concentração dedfTAT usados ​​entrega é independente da do MOI na mídia. Por exemplo, a concentração dfTAT pode ser mantida constante entre diferentes experiências para garantir a eficiência reprodutíveis no vazamento endossomal. Em contraste, a concentração de MOI em meios pode ser gradualmente mudada para atingir os níveis desejados de MOI entregue no citosol. A alta eficiência de fuga endossomal conseguido com dfTAT é notavelmente inócuo para muitas das células testados até à data. Esta é uma surpresa porque são organelos endocíticas componente importante das células e seria de esperar que o vazamento dramática mediada por dfTAT seria acompanhada por respostas celulares nocivos. No entanto, as células tratadas proliferam na mesma taxa como células não tratadas e não exibem qualquer alteração significativa no seu transcriptoma. Além disso, a entrega pode ser repetido dentro de minutos, com uma eficiência de entrega reprodutíveis, o que indica que as células podem tolerar ou recuperar do processo de entrega, sem perdera sua capacidade para a endocitose ou vazamento endossomal. Respostas celulares sutis, podem ocorrer durante o parto dfTAT e os detalhes moleculares de que essas respostas possam ser ainda precisam ser exploradas. No entanto, através da combinação de alta eficiência, conveniência de protocolos, e falta de toxicidade, esta abordagem de entrega deve provar imediatamente útil em muitas aplicações baseadas em células. Os protocolos aqui apresentadas visam tornar esta tecnologia acessível para a comunidade de pesquisa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Estratégias de entrega macromoleculares tipicamente utilizar a via endocítica como uma via de entrada celular. No entanto, endossomal aprisionamento limita severamente a eficiência com a qual macromoléculas penetrar no espaço citosólico de células. Recentemente, nós contornado este problema ao identificar o reagente dfTAT, um dímero de ligações dissulfureto da TAT péptido marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Geramos um dímero marcado por fluorescência do péptido TAT prototípico de penetração celular (CPP), dfTAT, que penetra as células vivas e atinge o espaço citosólico de células em particular com uma alta eficiência. Entrega citosólica de dfTAT é conseguida em várias linhas de células, incluindo células primárias. Além disso, a entrega não tem impacto sobre a viabilidade das células visivelmente, a proliferação ou a expressão do gene. dfTAT pode entregar pequenas moléculas, péptidos, anticorpos, enzimas biologicamente activas e um factor de transcrição. Neste relatório, nós descrevemos os protocolos envolvidos na dfTAT síntese e administração celular. O manuscrito descreve como controlar a quantidade da proteína entregue ao espaço citosólico de células, variando a quantidade de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, são discutidas as atuais limitações desta nova tecnologia e etapas envolvidas na validação de entrega. Os protocolos descritos devem ser extremamente útil para ensaios baseados em células bem como para a manipulação ex vivo e reprogramação das células.

Para avaliar a diferença entre fTAT e dfTAT, células HeLa são incubadas durante 1 hora com cada um dos péptidos para determinar a diferença na sua localização celular. A internalização dos dois CPP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência. A Figura 2 mostra que fTAT (20 uM) localiza em uma distribuição pontuada. Esta distribuição é consistente com o restante péptido retido no interior de endossomas. Em contraste, o sinal de fluorescência de dfTAT (5 uM) exibe uma distribui?...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K visualizações.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Vídeo: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...