Trata-se de um método alternativo e fácil de usar para fornecer genes de interesse aos ovos de camundongos fertilizados através da perfuração a laser da zona pellucida e da entrega de genes lentiviral. A perfuração assistida a laser do procedimento de doação de camundongos também pode ser aplicável aos óvulos fertilizados de outras espécies para facilitar a entrada de outros tipos de vírus ou reagentes de transfecção. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer habilidades especializadas para a micromanipulação e micro injeção dos ovos de camundongos fertilizados.
Demonstrando o procedimento de isolamento de ovos de rato fertilizado será Page Myers, um cientista pesquisador do ramo de Medicina Comparada do NIEHS. 16 a 24 horas após o acasalamento, isolar os ovários e ovários de camundongos fêmeas com plugues vaginais, de acordo com protocolos padrão. Quando todos os tecidos tiverem sido coletados, rasgue a ampola de cada ovário, e solte os óvulos fertilizados, cercados por células cumulosas, e transfira os ovos em células cumulantes para um prato de 35 milímetros contendo um x hyaluronidase em m2 médio fresco, para uma incubação de três a cinco minutos à temperatura ambiente.
Pipeta os ovos algumas vezes para liberar as células cumulajadas, e transfira os ovos para um novo prato de 35 milímetros contendo m2 médio, com pipetação para lavar a enzima. Em seguida, transfira os ovos lavados para um prato de 35 milímetros contendo meio otimizado de potássio, ou KSOM, e pipeta para lavar o m2 médio e hialuronidase restante. Em seguida, transfira os ovos para placas tratadas de cultura tecidual de 35 milímetros semeadas com 50 microliters de KSOM e dois mililitros de dimetilpolísiloxano para um equilíbrio de duas horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e oxigênio, e 90% de nitrogênio.
Enquanto os ovos estiverem na incubadora, configure e calibra o laser XYClone, de acordo com as recomendações do fabricante. Quando os ovos estiverem prontos, coloque a primeira placa de gota no estágio do microscópio laser e concentre manualmente a zona pellucida. Depois de confirmar que a luz LED laser é visível através do objetivo, mova o estágio do microscópio para atingir a zona com o laser LED, e use o software do computador para definir o laser XYClone para 250 microsegundos.
Ajuste o tamanho da luz LED para as dimensões apropriadas e perfure a zona pellucida de cada ovo três vezes com o laser para produzir três furos de 10 micrômetros. É fundamental realizar a perfuração rapidamente, mas com cuidado, pois os ovos fertilizados não podem ficar fora da incubadora por mais de 15 minutos. Em seguida, devolva os ovos perfurados à incubadora por mais duas horas.
No final da segunda incubação, trate a queda de 50 microliter KSOM com dois microliters de lentivírus concentrados sem misturar. E devolva os ovos à incubadora por quatro dias. Quando os ovos se desenvolverem em blastocistos, use um dispositivo de transferência de embriões não cirúrgicos, para depositar aproximadamente 10-15 embriões em cerca de dois microliters de KSOM.
17 dias após a transferência do embrião, permita que o camundongo gestante dê à luz naturalmente ou colete os recém-nascidos por cesariana, conforme necessário. Em seguida, coletar tecido dos filhotes para genotipagem, para determinar a taxa de transgênese. O desenvolvimento isolado e transduzido de óvulos fertilizados por camundongos pode ser verificado diariamente sob o microscópio.
60 a 70% dos embriões saudáveis e não tratados desenvolvem-se em blastocistos dentro de três a quatro dias. Enquanto cerca de 47% dos embriões perfurados a laser se desenvolvem em blastocistos, 85% dos quais expressam o gene de interesse tranduzido. Mirar o laser para afinar a zona, em vez de criar um buraco, permite que os embriões em desenvolvimento se beneficiem de uma zona pellucida intacta e encapsulante enquanto permanecem permissivos à transdução lentiviral.
A transdução com um lentivírus recombinante, expressando o GFP do copépod de um promotor fator de alongamento 1A induz múltiplas integrações lentivirais e uma alta expressão de GFP sob uma lâmpada LED azul. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que, embora a capacidade dos lentivírus se integrarem ao genoma hospedeiro, torna-os uma ferramenta poderosa para a entrega estável de genes, mas a integração aleatória também pode introduzir mutações insercionais. Essa técnica poderia permitir que pesquisadores da área da genética desenvolvessem rapidamente modelos de animais transgênicos para o estudo de doenças para produção de proteína in vivo, ou para estudos genéticos funcionais.
Após esse procedimento, outros métodos como a imunohistoquímica podem ser realizados em amostras de tecidos isolados de filhotes transduzidos para responder a perguntas adicionais sobre a localização e a extensão da expressão genética em vários tecidos de interesse. Não se esqueça que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso. Portanto, siga suas diretrizes institucionais para trabalhar com lentivírus.
Use roupas de proteção pessoal e descontamine todos os resíduos antes do descarte.
