O protocolo de ensaio de citotoxicidade usando linhagens celulares de peixe-zebra pode responder a perguntas sobre a toxicidade aguda de produtos químicos em peixes ou ajudar a definir as concentrações de teste apropriadas para outros ensaios alternativos de peixes. A principal vantagem deste ensaio de placa de 96 poços é combinar diferentes parâmetros de viabilidade para determinar a citotoxicidade para células de peixe-zebra, que é uma espécie de peixe importante em estudos de ecotoxicidade. O protocolo é muito simples.
Se você seguir todas as etapas descritas corretamente, não se deve encontrar nenhum problema. Este protocolo ajuda a não alcançar estudos de ecotoxicidade de base animal que avaliem os efeitos em linhagens celulares de peixes derivadas de diferentes órgãos ou fases da vida, como hepatócitos em células embrionárias. Para começar a chapear as células ZEM2S ou ZFL, calcule o volume das respectivas suspensões celulares necessárias para obter o número desejado de células para ensaios.
Encher um reservatório de reagente estéril com o meio de cultura completo para a linhagem celular correspondente e transferir o volume calculado da suspensão celular para o reservatório para um volume total de 20 mililitros. Usando uma pipeta multicanal, misture suavemente a solução para cima e para baixo sem formar espuma ou bolhas. Em seguida, usando a micropipeta multicanal, adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa transparente de poliestireno de 96 poços para obter uma contagem de células viável de 60.000 células por poço para as células ZEM2S e 40.000 células por poço para as células ZFL.
Incubar a placa a 28 graus Celsius por 24 horas. Para expor qualquer um dos tipos de células a diferentes concentrações dos produtos químicos em estudo, preparar a concentração desejada de soluções químicas em estudo nos meios de cultura para a linhagem celular de interesse sem soro fetal bovino ou FBS. Após a incubação de 24 horas, descarte cuidadosamente a mídia gasta dos poços usando uma micropipeta multicanal.
Em seguida, adicione 100 microlitros de uma determinada solução química de teste por poço em triplicados técnicos, o que significa três poços para cada concentração química de teste. Colocar os grupos de controlo na mesma placa que os produtos químicos de ensaio em triplicados técnicos. Para o controle em branco, adicione 100 microlitros do meio de exposição em três poços livres de células.
Para o controle negativo, adicione 100 microlitros do meio de exposição a três poços contendo células. Para o controle positivo, expor três poços contendo células a uma solução de 1%Triton X-100 preparada no meio de exposição. Selar as placas com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura e incubar as placas a 28 graus Celsius por 24 horas.
Após 24 horas da exposição ao produto químico em estudo, descarte cuidadosamente o meio de exposição dos poços, despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta e lave cada poço com 200 microlitros de PBS. Em seguida, para remover o PBS sem perder células, despeje-o cuidadosamente em uma bandeja de coleta. Para realizar os ensaios Alamar Blue ou AB e CFDA-AM, adicione 100 microlitros da respectiva solução por poço e incube a placa por 30 minutos no escuro a 28 graus Celsius.
Em seguida, meça a fluorescência em um leitor de placas de fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão adequados mencionados no texto. Para realizar o ensaio vermelho neutro ou NR, pegue a solução de trabalho NR com uma concentração de 40 microgramas por mililitro e centrifugar a 600 G por 10 minutos. Em seguida, remova cuidadosamente as soluções AB e CFDA-AM adicionadas anteriormente dos poços, despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
Usando uma micropipeta multicanal, adicione 100 microlitros da solução de trabalho NR por poço e incube a placa a 28 graus Celsius por três horas. Quando a incubação terminar, despeje cuidadosamente a solução NR da placa em uma bandeja de coleta e lave os poços adicionando 150 microlitros de PBS por poço. Após a lavagem, adicione 150 microlitros da solução de extração NR por poço e incube a placa agitando-a suavemente em um agitador de placas por 10 minutos antes de medir a absorvância a 540 nanômetros usando um leitor de placas.
Para realizar o ensaio de MTT, após a exposição química de teste de 24 horas, remova cuidadosamente o meio de exposição, despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta e usando uma micropipeta multicanal, adicione 100 microlitros de solução de trabalho de MTT por poço no escuro. Incube a placa a 28 graus Celsius por quatro horas no escuro. Em seguida, descarte a solução de MTT despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta e adicione 100 microlitros de DMSO em cada poço para extrair os cristais de formazan.
Incubar a placa em um agitador de placas por 10 minutos antes de medir a absorção a 517 nanômetros usando um leitor de placas. Para o ensaio de PA, os poços correspondentes a concentrações em branco, controle positivo e altamente citotóxico dos produtos químicos de teste mostraram cor azul e baixa fluorescência, indicando ausência ou redução de células viáveis. Em contraste, os poços correspondentes a baixas concentrações citotóxicas de produto químico em estudo e controle negativo contendo um alto número de células viáveis converteram a resazurina em resorufin rosa com maior fluorescência.
Para o ensaio NR, as concentrações altamente citotóxicas dos produtos químicos em estudo e o controle positivo são transparentes ou rosa pálido com baixa absorvência, enquanto os poços contendo células viáveis que retêm o corante NR apresentaram cor rosa escura e alta absorvência. Da mesma forma, para o ensaio de MTT, poços sem células viáveis são transparentes, enquanto aqueles que contêm células viáveis transformam MTT em formazan de cor violeta. Com base nas porcentagens de viabilidade celular calculadas, a concentração máxima de inibidor pela metade ou valor de IC50 foi estimada para os diferentes produtos químicos de teste nas linhagens celulares ZFL e ZEM2S.
Não foi observada diferença significativa na viabilidade celular para culturas com e sem FBS, indicando a adequação dos meios de cultura privados de FBS para o período de exposição química de 24 horas. Os ensaios de MTT e NR não mostraram efeito significativo da variação das concentrações de DMSO de 0,1% a 1% na viabilidade celular, indicando que essas linhagens celulares suportam o uso de DMSO como solvente até 1%Preste atenção especial ao manusear células chapeadas para evitar o autodesprendimento durante todo o procedimento e preparar cuidadosamente a solução de trabalho vermelha neutra para evitar qualquer precipitação de corante. Este procedimento pode ser aplicado a estudos que abordem vários aspectos dos efeitos químicos em peixes utilizando modelos in vitro e contribua para o progresso de nenhum estudo de ecotoxicidade de origem animal.
