Este ensaio pode ser empregado para quantificar citotoxicidade mediada por células T contra dois epítopos de peptídeos distintos de antígenos tumorais simultaneamente. A natureza in vivo deste ensaio permite que a função citotóxica das células T seja medida dentro da arquitetura intacta de um órgão linfoide secundário. Além disso, o assassinato observado é um reflexo preciso do número absoluto de células T, e não apenas de suas frequências, o que pode ser enganoso.
Este ensaio permite o exame das respostas citotóxicas das células T aos antígenos tumorais imunodominantes e sub-dominantes. Portanto, fornece informações valiosas quando você está projetando uma vacina, bem como protocolos imunoterapêuticos para câncer. Nosso protocolo foi adaptado para estudar respostas de células CD8 T.
No entanto, pode ser modificado para medir a citotoxicidade provocada por outros tipos de células assassinas, como células NK e linfócitos T inatas. Este ensaio requer experiência em técnica asséptica, manuseio de tecido de camundongos, preparação de células-alvo, bem como experiência em injeções de veias traseiras. É preciso adquirir esse conjunto de habilidades antes de tentar o ensaio de assassinato in vivo.
Uma vez que a linha de células tumorais aderentes T-antígeno-positivo tenha se tornado totalmente confluente ou ligeiramente confluente, enxágue suavemente a monocamada com PBS estéril e quente e desprende as células tumorais com 0,25% de trippsina EDTA em um armário de biossegurança. Toque nas laterais do frasco de cultura várias vezes para liberar as células aderentes restantes, e pare a reação após cerca de cinco minutos com a adição de cinco mililitros de meio DMEM. Pipetar a solução celular algumas vezes antes de filtrar a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.
Colete as células por centrifugação, e resuspenque a pelota em 10 mililitros de PBS estéril e frio para a primeira de três lavagens sob as mesmas condições. Após a terceira lavagem, resuspenque as células em quatro vezes 10 a sete células por mililitro de concentração de PBS estéril, e injete 500 microliters da suspensão celular tumoral T-antígeno positivo intraperitonealmente em cada rato C57 Black 6 de seis a 12 semanas de idade. Para a preparação do esplenócito alvo, coloque o rato doador eutanizado na posição propensa e pulverize o animal com 70% de etanol.
Usando fórceps estéreis e tesouras, levante a pele e faça uma pequena incisão de linha média ventral. Corte a pele de forma transversal para expor o peritônio, e use os fórceps para puxar o peritônio de forma semelhante a uma tenda, sem pegar nenhum dos órgãos internos. Corte o peritônio para expor a cavidade peritêneo, e transfira suavemente o baço para um moedor de tecido Dounce de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS estéreis.
Use o êmbolo para aplicar pressão manual até que o tecido esplênico se dissipe em uma suspensão celular homogênea vermelha e transfira o homogeneado para um tubo de 15 mililitros. Colete a suspensão por centrífugação e resuspense a pelota em quatro mililitros de tampão de potássio de cloreto de amônio para eliminar os eritrócitos. Após quatro minutos, pare o processo com oito mililitros de meio completo e filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros.
Separe os glóbulos brancos dos detritos dos glóbulos vermelhos por centrifugação, e resuspenque a pelota em 12 mililitros de meio completo. Em seguida, divida a suspensão do esplenócito em três alíquotas iguais de quatro mililitros. Para codificação de peptídeos dos esplenócitos alvo, pulso um aliquot de esplenócito com um micromolar de peptídeo irrelevante, um aliquot com um micromolar de peptídeo local I, e um aliquot com um micromolar de peptídeo local IV por uma hora a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono.
No final da incubação, remova o excesso de peptídeo por centrifugação e lave os esplenócitos pulsados com peptídeo duas vezes em 12 mililitros de PBS frio estéril por lavagem por tubo. Após a segunda lavagem, resuspenque as células em quatro mililitros de PBS fresco e estéril por tubo. Adicione 025, 0,25 e CFSE de dois micromolares nas irrelevantes suspensões de esplenócitos pulsadas pelo local I e pelo local IV, respectivamente.
Coloque os tubos a 37 graus Celsius por 15 minutos com inversão manual uma vez a cada cinco minutos. No final da incubação, adicione três mililitros de soro bovino fetal inativado a calor em cada tubo para parar a reação de CFSE e trazer o volume final em cada tubo até 15 mililitros com PBS. Em seguida, colete as células com rótulo de corante por centrifugação para duas lavagens em 12 mililitros de PBS fresco e estéril por lavagem.
Para confirmar uma rotulagem CFSE adequada dos esplenócitos de destino, resuspenque a pelota em três mililitros de PBS e misture com vórtices suaves. Transfira 10 microliters de cada suspensão celular rotulada por CFSE para uma classificação celular de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros, ou tubo FACS, contendo PBS, e carregue o tubo em um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nanômetros. No software do citómetro de fluxo, crie um portão de linfócitos com base nas propriedades de dispersão dianteira e dispersão lateral das células antes de adquirir 5.000 eventos que caem dentro do portão de linfócitos no canal Fluorescence 1.
Dentro da população pai CFSE-positive, desenhe portões de histograma adicionais para identificar as subpopulações CFSE-low, CFSE-intermediate e CFSE-high. Em seguida, confirme um número de evento igual ou quase igual dentro dos três portões para os outros dois tubos de células rotuladas. Para a injeção das células-alvo, primeiro o vórtice suavemente os tubos de origem e acovo as três suspensões celulares rotuladas por CFSE em um novo tubo em proporções iguais.
Cubra o conteúdo do tubo com PBS estéril e colete as células por centrifugação para contar. Em seguida, ajuste o volume para uma única vezes 10 para as sete células-alvo mistas por 200 microliters de PBS por concentração de receptor, e injete 200 volumes de microliter da suspensão celular na veia traseira de cada rato C57 Black 6 receptor. Duas ou quatro horas após a injeção, remova e processe o baço de cada animal receptor como demonstrado, e resuspenque os glóbulos brancos isolados em três mililitros de PBS por baço.
Transfira aproximadamente uma vez 10 para as sete células de cada baço processado em um tubo FACS limpo, e execute imediatamente as células no cítmetro de fluxo, como demonstrado para portalar as populações de células-alvo baixas, intermediárias e altas células-alvo do CFSE. Em seguida, adquira um total de 2.000 eventos CFSE-baixo no canal Fluorescence 1, e calcule a lise específica de cada população de células-alvo cogina de acordo com a fórmula detalhada no texto. Neste experimento representativo, o sucesso do esgotamento das células T regulatórias de ocorrência natural em camundongos injetados com anticorpo monoclonal anti-CD25 foi confirmado pela citometria de fluxo.
Como esperado, picos quase iguais correspondentes ao controle e células-alvo coginadas foram detectáveis em camundongos ingênuos. Em contraste, as células-alvo de exibição local-IV estavam quase completamente ausentes em camundongos t-antígenos, independentemente de seu tratamento prévio com anticorpo monoclonal anti-CD25 ou PBS. Curiosamente, o esgotamento natural das células T reg por anticorpo monoclonal anti-CD25 aumentado in vivo citotóxico T-linfócitos mediados lysis de células-alvo com pulso local I.
Nesta segunda investigação representativa, o bloqueio programado de morte 1 aumentou os locais sub-dominantes de células T CD8 positivos uma e duas respostas específicas, sugerindo que interferir com a morte programada 1/ligante de morte programada 1 interações pode induzir a propagação de epitope em respostas de células T anti-câncer CD8-positivos. É fundamental ao rotular suas células doadoras com CFSE, certifique-se de que suas concentrações são precisas. Caso contrário, isso pode resultar em sobreposição de picos de histograma, o que dificulta seus cálculos e interpretação de dados necessários, se não impossível.
Será importante otimizar ensaios in vivo de citotoxicidade para quantificar funções de efeitos provocadas por diferentes tipos de células assassinas que reconhecem peptídeos e antígenos não peptídeos no mesmo hospedeiro.
