Dieser Assay kann verwendet werden, um T-Zell-vermittelte Zytotoxizität gegen zwei unterschiedliche Peptid-Epitope von Tumorantigenen gleichzeitig zu quantifizieren. Die in vivo Natur dieses Assays ermöglicht es, die zytotoxische Funktion von T-Zellen innerhalb der intakten Architektur eines sekundären Lymphorgans zu messen. Darüber hinaus ist die beobachtete Tötung eine genaue Widerspiegelung der absoluten Anzahl von T-Zellen, und nicht nur ihrer Frequenzen, die irreführend sein können.
Dieser Test ermöglicht die Untersuchung von zytotoxischen T-Zell-Antworten auf immundominante und subdominante Tumorantigene. Es liefert daher wertvolle Informationen, wenn Sie einen Impfstoff entwerfen, sowie immuntherapeutische Protokolle für Krebs. Unser Protokoll wurde auf die Untersuchung von CD8 T-Zellreaktionen zugeschnitten.
Es kann jedoch modifiziert werden, um die Zytotoxizität zu messen, die von anderen Killerzelltypen wie NK-Zellen und angeborenen T-Lymphozyten ausgelöst wird. Dieser Test erfordert Erfahrung in der aseptischen Technik, Mausgewebehandhabung, Zielzellvorbereitung, sowie Expertise in Schwanzveneninjektionen. Man muss diese Fertigkeit erwerben, bevor man den in vivo Töten assay versucht.
Sobald die T-Antigen-positive anhängliche Tumorzelllinie vollständig konfluent oder leicht überflussend geworden ist, spülen Sie die Monoschicht vorsichtig mit sterilem, warmem PBS ab und lösen Sie die Tumorzellen mit 0,25% Trypsin EDTA in einem Biosicherheitsschrank. Tippen Sie mehrmals auf die Seiten des Kulturkolbens, um die verbleibenden haftenden Zellen freizusetzen, und stoppen Sie die Reaktion nach etwa fünf Minuten mit der Zugabe von fünf MilliliterDM-Medium. Pipette die Zelllösung ein paar Mal vor der Filterung der Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Porenzellsieb in eine 50-Milliliter konische Röhre.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter sterilen, kalten PBS für die erste von drei Wärzahlen unter den gleichen Bedingungen. Nach der dritten Wäsche die Zellen viermal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter steriler PBS-Konzentration wieder aussetzen und 500 Mikroliter der T-Antigen-positiven Tumorzellsuspension intraperitoneal in jeden sechs bis 12 Wochen alten C57 Black 6-Mausempfänger injizieren. Für die Ziel-Splenozyten-Präparation die eingeschläferte Spendermaus in die anfällige Position bringen und das Tier mit 70% Ethanol besprühen.
Mit sterilen Zangen und Scheren, heben Sie die Haut und machen einen kleinen ventralen Mittellinienschnitt. Schneiden Sie die Haut kreuzweise, um das Peritoneum freizulegen, und verwenden Sie die Zange, um das Peritoneum in einer zeltartigen Art und Weise hochzuziehen, ohne eines der inneren Organe zu fangen. Schneiden Sie das Peritoneum auf, um die Peritonealhöhle freizulegen, und übertragen Sie die Milz vorsichtig auf einen 15-Milliliter-Dounce-Gewebeschleifer, der fünf Milliliter steriles PBS enthält.
Verwenden Sie den Kolben, um manuellen Druck auszuüben, bis sich das Milzgewebe in eine rote homogene Zellsuspension zerstreut, und übertragen Sie das Homogenat in ein 15-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie die Suspension durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in vier Milliliter Ammoniumchlorid Kaliumlysinpuffer, um die Erythrozyten zu beseitigen. Nach vier Minuten den Prozess mit acht Millilitern komplettem Medium beenden und die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Porenzellsieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr filtern.
Trennen Sie die weißen Blutkörperchen von den roten Blutkörperchen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 12 Milliliter des vollständigen Mediums wieder auf. Dann teilen Sie die Splenozytensuspension in drei gleiche Vier-Milliliter-Aliquots. Für die Peptidkodierung der Zielsplenozyten, Puls ein Splenocyte aliquot mit einem Mikromolaren irrelevanten Peptid, ein Aliquot mit einem Mikromolar von Site I Peptid, und ein Aliquot mit einem Mikromolar der Site IV Peptid für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5%Kohlendioxid.
Am Ende der Inkubation das überschüssige Peptid durch Zentrifugation entfernen und die Peptid-gepulsten Splenozyten zweimal in 12 Milliliter steriler, kalter PBS pro Waschleitung waschen. Nach der zweiten Wäsche die Zellen in vier Millilitern frischer, steriler PBS pro Tube wieder aussetzen. Fügen Sie 025, 0.25 und zweimikromolare CFSE in die irrelevanten, Site I- und Site IV-Peptid-gepulsten Splenozytensuspensionen hinzu.
Legen Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit manueller Inversion einmal alle fünf Minuten. Am Ende der Inkubation drei Milliliter wärmeinaktiviertes fetales Rinderserum in jedes Rohr geben, um die CFSE-Reaktion zu stoppen und das Endvolumen in jeder Röhre mit PBS auf 15 Milliliter zu bringen. Dann sammeln Sie die farbstoffmarkierten Zellen durch Zentrifugation für zwei Wäschen in 12 Milliliter frische, sterile PBS pro Wäsche.
Um eine adäquate CFSE-Kennzeichnung der Zielsplenozyten zu bestätigen, setzen Sie das Pellet in drei Milliliter PBS wieder auf und mischen Sie es mit sanftem Wirbel. Übertragen Sie 10 Mikroliter aus jeder CFSE-beschrifteten Zellsuspension in eine einzelne fünf Milliliter runde Polystyrolfluoreszenz-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder FACS-Röhre, die PBS enthält, und laden Sie das Rohr auf ein Durchflusszytometer, das mit einem 488-Nanometer-Laser ausgestattet ist. Erstellen Sie in der Durchflusszytometer-Software ein Lymphozytentor basierend auf den vorwärtsstreuenden und seitlichen Streueigenschaften der Zellen, bevor Sie 5.000 Ereignisse erfassen, die innerhalb des Lymphozytentors im Fluoreszenz-1-Kanal liegen.
Ziehen Sie innerhalb der übergeordneten CFSE-positiven Population zusätzliche Histogramm-Gates, um die CFSE-niedrigen, CFSE-Zwischen- und CFSE-hohen Subpopulationen zu identifizieren. Bestätigen Sie dann eine gleiche oder eine nahezu gleiche Ereigniszahl innerhalb der drei Tore für die beiden anderen Röhren beschrifteter Zellen. Zur Injektion der Zielzellen zunächst die Quellrohre sanft wirbeln und die drei CFSE-beschrifteten Zellsuspensionen in gleichem Verhältnis in ein neues Rohr bündeln.
Den Rohrinhalt mit sterilem PBS aufladen und die Zellen durch Zentrifugation zum Zählen sammeln. Passen Sie dann das Volumen auf ein mal 10 auf die sieben gemischten Zielzellen pro 200 Mikroliter PBS pro Empfängerkonzentration an und injizieren Sie 200 Mikroliter Volumen der Zellsuspension in die Schwanzvene jeder Empfänger-C57 Black 6-Maus. Zwei oder vier Stunden nach der Injektion entfernen und verarbeiten Sie die Milz jedes Empfängertiers wie gezeigt, und setzen Sie die isolierten weißen Blutkörperchen in drei Milliliter PBS pro Milz wieder aus.
Übertragen Sie etwa ein mal 10 auf die sieben Zellen von jeder verarbeiteten Milz in ein sauberes FACS-Rohr, und führen Sie die Zellen sofort auf dem Durchflusszytometer aus, wie gezeigt, um die CFSE-niedrigen, mittleren und hohen Zielzellpopulationen zu begehen. Erfassen Sie dann insgesamt 2.000 CFSE-niedrige Ereignisse im Fluoreszenz-1-Kanal und berechnen Sie die spezifische Lyse jeder Cognate-Zielzellpopulation gemäß der im Text beschriebenen Formel. In diesem repräsentativen Experiment wurde der Erfolg der Erschöpfung natürlich vorkommender regulatorischer T-Zellen bei Mäusen, die mit monoklonalen Anti-CD25-Antikörpern injiziert wurden, durch Durchflusszytometrie bestätigt.
Wie erwartet, waren nahezu gleiche Spitzen, die den Kontroll- und Kognate-Zielzellen entsprachen, bei naiven Mäusen nachweisbar. Im Gegensatz dazu fehlten Site-IV-Anzeige-Zielzellen bei T-Antigen-primed-Mäusen fast vollständig, unabhängig von ihrer vorherigen Behandlung mit anti-CD25 monoklonalen Antikörpern oder PBS. Interessanterweise, natürlich vorkommende T reg Zellerschöpfung durch Anti-CD25 monoklonalen Antikörper augmented in vivo cytotoxische T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von Site-I-gepulsten Zielzellen.
In dieser zweiten repräsentativen Untersuchung verstärkte programmierte Todesblockade 1 die subdominanten CD8-positiven T-Zellenstandorte ein- und zwei-schräg-drei-spezifische Reaktionen, was darauf hindeutet, dass die Störung des programmierten Todes 1/programmierter Todesliganden-1-Wechselwirkungen zu epitopischer Ausbreitung in Anti-Krebs-CD8-positiven T-Zellreaktionen führen kann. Es ist wichtig, wenn Sie Ihre Spenderzellen mit CFSE kennzeichnen, stellen Sie sicher, dass Ihre Konzentrationen präzise sind. Andernfalls kann dies zu überlappenden Histogrammspitzen führen, die Ihre erforderlichen Berechnungen und Dateninterpretationen erschweren, wenn nicht gar unmöglich machen.
Es wird wichtig sein, In-vivo-Zytotoxizitätstests zu optimieren, um Effektorfunktionen zu quantifizieren, die von verschiedenen Killerzelltypen ausgelöst werden, die Peptid- und Nicht-Peptid-Antigene im selben Wirt erkennen.
