이 분석체는 종양 항원의 두 가지 뚜렷한 펩티드 전형에 대해 T 세포 매개 세포 독성을 동시에 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이 분석의 생체 내 특성은 T 세포의 세포 독성 기능을 이차 림프구 기관의 그대로 아키텍처 내에서 측정할 수 있게 합니다. 또한, 관찰 된 살인은 T 세포의 절대 수의 정확한 반영이며, 단지 그들의 주파수뿐만 아니라 오해의 소지가있을 수 있습니다.
이 분석은 면역 지배적이고 하위 지배적인 종양 항원에 세포 독성 T 세포 반응의 검사를 가능하게 합니다. 따라서 백신을 설계할 때 귀중한 정보와 암용 면역 치료 프로토콜을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 CD8 T 세포 반응을 연구하도록 조정되었습니다.
그러나, NK 세포 및 선천성 같은 T 림프구와 같은 다른 킬러 세포 유형에 의해 유도된 세포 독성을 측정하도록 수정될 수 있다. 이 분석법은 무균 기술, 마우스 조직 처리, 표적 세포 준비뿐만 아니라 꼬리 정맥 주사에 대한 전문 지식에 대한 경험이 필요합니다. 하나는 생체 내 살인 분석기를 시도하기 전에 이 기술 세트를 획득해야합니다.
T-항원 양성 부착 종양 세포주가 완전히 컨서우리 또는 약간 과도하게 수렴되면, 살균, 따뜻한 PBS로 단층을 부드럽게 헹구고, 생체 안전 캐비닛에서 0.25%의 트립신 EDTA로 종양 세포를 분리한다. 배양물의 측면을 여러 번 탭하여 나머지 부착 세포를 방출하고 DMEM 배지의 5밀리리터를 첨가하여 약 5분 후에 반응을 중지한다. 70마이크로미터-모공 세포 여과기를 통해 셀 서스펜션을 50밀리리터 원유형 튜브로 필터링하기 전에 셀 용액을 몇 번 피펫합니다.
원심분리에 의해 세포를 수집하고, 동일한 조건하에서 세 개의 세개의 세차재의 첫 번째에 대한 멸균, 감기 PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 세 번째 세척 후, 멸균 PBS 농도의 밀리리터 당 7개의 세포에 4회 10번으로 세포를 재보중단하고, T-항원 양성 종양 세포 현탁액의 500마이크로리터를 각 6-12주 된 C57 Black 6 마우스 수신자에게 내회음부한다. 대상 비장 제제의 경우 안락사 된 기증자 마우스를 경향이있는 위치에 놓고 동물을 70 %에탄올로 분사하십시오.
멸균 집게와 가위를 사용하여 피부를 들어 올리고 작은 복부 중간 선 절개를합니다. 피부와 같은 방식으로 피부를 잘라 내어 회중을 노출시키고, 집게를 사용하여 내부 장기를 잡지 않고 텐트와 같은 방식으로 회대를 끌어 올수 있습니다. 복막 구멍을 열어 복막 구멍을 노출시키고 비장을 멸균 PBS 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 Dounce 조직 분쇄기로 부드럽게 옮겨냅니다.
플런저를 사용하여 비장 조직이 적색 균질 세포 현탁액으로 방출될 때까지 수동 압력을 적용하고 동종을 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 원심분리에 의해 현탁액을 수집하고, 적혈구를 제거하기 위해 염화 칼륨 분해 칼륨 버퍼의 4 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 4분 후, 완전한 배지의 8밀리리터로 공정을 중단하고, 70마이크로미터-모공 세포 여과기를 통해 새로운 50밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 걸러냅니다.
백혈구를 적혈구 파편으로부터 원심분리하여 분리하고, 완전한 배지의 12 밀리리터에서 펠릿을 재보펜한다. 그런 다음 비장 분리액을 3개의 동일한 4밀리리터 알리쿼트로 분할합니다. 표적 비장 세포의 펩티드 코딩을 위해, 1개의 비장 구균 알리코와 무관펩티드의 1개의 마이크로몰라, 1개의 마이크로몰라를 가진 1개의 알리코트, 그리고 사이트 IV 펩티드의 1개의 마이크로몰라를 37°C와 5%의 이산화탄소에서 1시간 동안 1개의 알리쿼트를 가진 펄스.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 과잉 펩티드를 제거하고 튜브 당 세척당 12 밀리리터, 차가운 PBS에서 펩티드 펄스 비백구를 두 번 세척한다. 두 번째 세척 후 튜브 당 신선하고 멸균 된 PBS의 4 밀리리터로 세포를 다시 중단하십시오. 각각 025, 0.25 및 2마이크로몰러 CFSE를 무관, 사이트 I 및 Site IV 펩티드 펄스 비장 염현에 추가합니다.
5분마다 한 번씩 수동 반전으로 15분간 튜브를 섭씨 37도에 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, CFSE 반응을 중지하고 PBS와 각 튜브에 최종 볼륨을 가지고 각 튜브에 열 비활성화 태아 소 혈청의 세 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 세척당 신선하고 멸균된 PBS의 12 밀리리터에서 2개의 세척에 대해 원심분리에 의해 염료 표지 세포를 수집합니다.
대상 비장 세포의 적절한 CFSE 라벨링을 확인하려면 PBS의 3 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 부드러운 소용돌이와 혼합하십시오. 각 CFSE 표지된 세포 현탁액에서 10마이크로리터를 개별 5밀리리터 라운드 바닥 폴리스티렌 형광 활성화 셀 분류 또는 FACS 튜브로 전송하고 PBS를 함유하고 488나노미터 레이저가 장착된 유동 사이토미터에 튜브를 로드합니다. 유동 세포계 소프트웨어에서, 형광 1 채널의 림프구 게이트 내에 떨어지는 5, 000 이벤트를 획득하기 전에 세포의 전방 분산 및 측면 산란 특성에 기초하여 림프구 게이트를 생성한다.
부모 CFSE 양성 인구 내에서 CFSE-로우, CFSE-중간 체및 CFSE 높은 하위 모집단을 식별하기 위해 추가 히스토그램 게이트를 그립니다. 그런 다음 표지된 세포의 다른 두 튜브에 대해 세 개의 게이트 내에서 동일하거나 거의 동등한 이벤트 번호를 확인합니다. 표적 세포의 주입을 위해, 먼저 소스 튜브를 부드럽게 소용돌이시키고 3개의 CFSE 표지된 세포 현탁액을 동일한 비율로 새로운 튜브로 풀링합니다.
멸균 PBS로 튜브 함량을 위로하고 계산을 위한 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 그런 다음 수신자 농도당 PBS의 200 마이크로리터당 7개의 혼합 표적 세포에 10배씩 부피를 조정하고, 각 수신자 C57 Black 6 마우스의 꼬리 정맥에 세포 현탁액의 200 마이크로리터 부피를 주입한다. 주사 후 2~4시간 후에 각 수용인 동물의 비장을 제거하고 처리하며 비장당 PBS의 3밀리리터에서 격리된 백혈구를 재중단한다.
각 처리된 비장에서 7개의 세포로 약 10번을 깨끗한 FACS 튜브로 옮기고, CFSE-low, 중간 및 높은 표적 세포 집단을 게이트하는 것으로 입증된 바와 같이 흐름 사이토미터상 세포를 즉시 실행한다. 그런 다음 형광 1 채널에서 총 2, 000 CFSE-로우 이벤트를 획득하고 텍스트에 상세한 수식에 따라 각 코그네이트 표적 세포 집단의 특정 용액을 계산합니다. 본 대표적인 실험에서, 항CD25 단클론 항체를 주입한 마우스에서 자연적으로 발생하는 규제 T세포의 고갈의 성공은 유동 세포측정에 의해 확인되었다.
예상대로, 대조군 및 코그네이트 표적 세포에 대응하는 거의 동등한 피크는 순진한 마우스에서 검출되었다. 대조적으로, 사이트-IV 표시 표적 세포는 항 CD25 단클론 항체 또는 PBS를 가진 그들의 이전 처리에 관계없이 T-항원 프라이밍 마우스에서 거의 완전히 결석했습니다. 흥미롭게도, 자연발생적인 T 레지 세포 고갈은 부위-I 펄스 표적 세포의 생체 내 세포 독성 T-림프구 매개 용액으로 증강된 항 CD25 단클론 항체에 의한 고갈.
이 두 번째 대표적인 조사에서, 프로그램된 죽음 1 봉쇄는 서브 지배적인 CD8 양성 T 세포 사이트 1개 및 2-슬래시-3특이적 반응을 강화하여, 프로그램된 죽음 리간드 1 상호작용에 간섭하는 것이 항암 CD8 양성 T 세포 반응에서 에피토프 확산을 유도할 수 있음을 시사한다. CFSE로 기증자 세포를 라벨링할 때 농도가 정확한지 확인하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 히스토그램 피크가 겹쳐서 필요한 계산과 데이터 해석이 불가능하지는 않더라도 어려울 수 있습니다.
동일한 숙주에서 펩타이드 및 비펩티드 항원을 인식하는 다른 킬러 세포 유형에 의해 유도된 이펙터 기능을 정량화하기 위해 생체 내 세포 독성 작용체에서 최적화하는 것이 중요합니다.
