Этот анализ может быть использован для количественной оценки цитотоксичности Т-клеток против двух различных пептидных эпитопов опухолевых антигенов одновременно. Виво характер этого анализа позволяет цитотоксической функции Т-клеток, которые будут измеряться в нетронутой архитектуры вторичного лимфоидного органа. Кроме того, наблюдаемое убийство является точным отражением абсолютного числа Т-клеток, а не только их частот, что может вводить в заблуждение.
Этот анализ позволяет изучат цитотоксические Т-клеточные реакции на иммунодоминантные и субдоминантные опухолевые антигены. Поэтому он предоставляет ценную информацию, когда вы проектируете вакцину, а также иммунотерапевтические протоколы для рака. Наш протокол был разработан для изучения ответов на CD8 T-клеток.
Тем не менее, он может быть изменен для измерения цитотоксичности, вызываемой другими типами клеток-убийц, таких как НК-клетки и врожденные Т-лимфоциты. Этот анализ требует опыта в асептической технике, обработки тканей мыши, подготовки целевых клеток, а также опыта в инъекциях хвостовых вен. Нужно приобрести этот набор навыков, прежде чем пытаться in vivo убийство анализа.
После того, как Т-антиген-положительный адепт линии опухолевых клеток стал полностью слияние или слегка более-слияние, осторожно промыть монослой с стерильной, теплой PBS, и отделить опухолевые клетки с 0,25%трипсина ЭДТА в биобезопасности кабинета. Нажмите на стороны культуры колбу несколько раз, чтобы освободить оставшиеся клетки адепта, и остановить реакцию примерно через пять минут с добавлением пяти миллилитров DMEM среды. Pipette клеточный раствор несколько раз, прежде чем фильтровать подвеску клетки через 70-микрометровый ситечко клеток в 50-миллилитровую коническую трубку.
Соберите клетки путем центрифугации, и повторно поместить гранулы в 10 миллилитров стерильных, холодных PBS для первого из трех моет в тех же условиях. После третьего мытья, повторного введения клеток в четыре раза от 10 до семи клеток на миллилитр стерильной концентрации PBS, и вводить 500 микролитров Т-антиген-положительной опухолевой клетки подвески интраперитонально в каждом шесть-к-12-недельный C57 Черный 6 мыши получателя. Для подготовки целевых спеноцитов поместите усыпляемую донорскую мышь в положение, подверженное риску, и распылите животное 70%этанолом.
Используя стерильные типсы и ножницы, поднимите кожу и сделайте небольшой брюшной разрез средней линии. Вырезать кожу в кросс-как мода подвергать брюшной полости, и использовать типсы, чтобы подтянуть брюшной полости в палатке, как мода, не ловя любой из внутренних органов. Разрежьте брюшной полости, чтобы разоблачить брюшной полости, и осторожно перенести селезенку на 15-миллилитровый ткани Dounce шлифовальный станок, содержащий пять миллилитров стерильных PBS.
Используйте поршень, чтобы применить ручное давление, пока splenic ткани рассеивается в красной однородной подвески клеток, и передачи однородности в 15-миллилитровую трубку. Соберите суспензию центрифугации, и повторно гранулы в четырех миллилитров хлорида аммония хлорид калия лизин буфер для устранения эритроцитов. Через четыре минуты, остановить процесс с восемью миллилитров полной среды, и фильтровать подвеску клетки через 70-микрометр-поры клеток ситечко в новую 50-миллилитровую трубку.
Отделить белые кровяные тельца от красных кровяных клеток мусора центрифугации, и повторно гранулы в 12 миллилитров полной среды. Затем разделите суспензию спеноцитов на три равных четырехми миллилитровых алицита. Для пептидного кодирования целевых спеноцитов пульс один splenocyte aliquot с одним микромоляном нерелевантного пептида, один aliquot с одним микромоляном пептида сайта I, и один aliquot с одним микромоляном пептида сайта IV в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе.
В конце инкубации, удалить избыток пептида центрифугации и мыть пептид-импульсных спеноцитов два раза в 12 миллилитров стерильных, холодных PBS на стирку на трубку. После второй стирки, повторного перерасхода клеток в четыре миллилитров свежих, стерильных PBS на трубку. Добавьте 025, 0,25 и двухмикролограммовые CFSE в нерелевантные, Site I и Site IV пептид-импульсные подвески спеноцитов соответственно.
Поместите трубки при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут с ручной инверсией один раз в пять минут. В конце инкубации добавьте три миллилитров тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота в каждую трубку, чтобы остановить реакцию CFSE и довести окончательный объем в каждой трубке до 15 миллилитров с PBS. Затем соберите красителя помечены клетки центрифугации в течение двух моет в 12 миллилитров свежих, стерильных PBS за стирку.
Чтобы подтвердить адекватную маркировку CFSE целевых спеноцитов, повторно поместите гранулы в трех миллилитров PBS и смешайте с нежным вихрем. Передача 10 микролитров от каждого CFSE помечены клеточной подвески в отдельных пятими миллилитров круглый нижний полистирол флуоресценции активированной сортировки клеток, или FACS трубки, содержащей PBS, и загрузить трубку на поток цитометра оснащен 488-нанометровый лазер. В программном обеспечении цитометра потока создайте ворота лимфоцитов на основе впередового рассеяния и боковых свойств рассеяния клеток, прежде чем приобрести 5 000 событий, попадающих в ворота лимфоцитов в канале Fluorescence 1.
В родительской CFSE-позитивной популяции, привлечь дополнительные ворота гистограммы для выявления CFSE-низкий, CFSE-промежуточных и CFSE-высоких субпопуляций. Затем подтвердите равное или почти равное число событий в пределах трех ворот для двух других труб помеченных ячеек. Для инъекции целевых клеток сначала аккуратно вихрем исходные трубки и объединить три CFSE помеченных клеточных суспензий в новую трубку при равных соотношениях.
Пополнить содержимое трубки стерильным PBS, и собирать клетки центрифугации для подсчета. Затем отрегулируйте громкость в один раз от 10 до семи смешанных целевых ячеек на 200 микролитров PBS на концентрацию получателя и ввилите 200 микролитровых объемов клеточной подвески в хвостовую вену каждого получателя C57 Black 6 мыши. Через два или четыре часа после инъекции, удалить и обработать селезенку каждого животного-реципиента, как попродемонстрировано, и повторно изолированных белых кровяных клеток в три миллилитров PBS на селезенку.
Передача примерно один раз 10 к семи клеткам из каждой обработанной селезенки в чистую трубку FACS, и сразу же запустить клетки на цитометре потока, как попродемонстрировано ворот CFSE-низких, промежуточных и высоких целевых популяций клеток. Затем приобрети в общей сложности 2 000 событий CFSE-низких в канале Fluorescence 1 и вычислите конкретный лиз каждой целевой популяции cognate в соответствии с формулой, подробно описанной в тексте. В этом репрезентативном эксперименте успех истощения естественных регуляторных Т-клеток у мышей, вводимых анти-CD25 моноклональным антителом, был подтвержден цитометрией потока.
Как и ожидалось, почти равные пики, соответствующие клеткам-мишеням контроля и cognate, были обнаружены у наивных мышей. В отличие от сайта-IV-отображения целевых клеток почти полностью отсутствуют в Т-антиген-премьер мышей, независимо от их предварительного лечения анти-CD25 моноклональных антител или PBS. Интересно, что естественное истощение клеток T reg анти-CD25 моноклональным антителом, увеличенным в виво цитотоксическим Т-лимфоцит-опосредованном лизе site-I-pulsed целевых клеток.
В этом втором репрезентативном расследовании, запрограммированной смерти 1 блокады расширения суб-доминирующей CD8-положительных Т-клеток сайтов один и два-слэш-три конкретных ответов, предполагая, что вмешательство в запрограммированной смерти 1 / запрограммированной смерти лиганд 1 взаимодействия могут вызвать эпитоп распространения в борьбе с раком CD8-положительных Т-клеток ответов. Очень важно, когда маркировка донорских клеток с CFSE, убедитесь, что ваши концентрации являются точными. В противном случае это может привести к перекрытию пиков гистограммы, что затрудняет, если не невозможно, необходимые расчеты и интерпретацию данных.
Важно оптимизировать анализы цитотоксии in vivo для количественной оценки функций эффектора, вызываемых различными типами клеток-убийц, которые распознают пептидные и нестиптийные антигены в одном и том же хозяине.
