Questo saggio può essere impiegato per quantificare la citotossicità mediata da cellule T contro due distinti epitopi peptidici di antigeni tumorali contemporaneamente. La natura in vivo di questo saggio consente di misurare la funzione citotossica delle cellule T all'interno dell'architettura intatta di un organo linfoide secondario. Inoltre, l'uccisione osservata è un riflesso accurato del numero assoluto di cellule T, e non solo delle loro frequenze, il che può essere fuorviante.
Questo test consente l'esame delle risposte citotossiche delle cellule T agli antigeni tumorali immunodominanti e sub-dominanti. Fornisce quindi informazioni preziose quando si progetta un vaccino, così come protocolli immunoterapeutici per il cancro. Il nostro protocollo è stato su misura per studiare le risposte alle cellule CD8 T.
Tuttavia, può essere modificato per misurare la citotossicità suscitata da altri tipi di cellule killer, come le cellule NK e i linfociti T innati. Questo test richiede esperienza nella tecnica aseptica, nella manipolazione del tessuto del topo, nella preparazione delle cellule bersaglio e nell'esperienza nelle iniezioni delle vene della coda. Bisogna acquisire questo set di abilità prima di tentare il saggio di uccisione in vivo.
Una volta che la linea cellulare tumorale aderente aderente all'antigene T è diventata completamente confluente o leggermente troppo confluente, sciacquare delicatamente il monostrato con PBS sterile e caldo e staccare le cellule tumorali con EDTA allo 0,25% di tripside in un armadietto di biosicurezza. Toccare più volte i lati del pallone di coltura per rilasciare le restanti cellule aderenti e interrompere la reazione dopo circa cinque minuti con l'aggiunta di cinque millilitri di mezzo DMEM. Pipettare la soluzione cellulare alcune volte prima di filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino a celle a pori da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.
Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare il pellet in 10 millilitri di PBS sterile e freddo per il primo di tre lavaggi nelle stesse condizioni. Dopo il terzo lavaggio, resospensare le cellule a un quattro per 10 alle sette cellule per millilitro di concentrazione sterile di PBS, e iniettare 500 microlitri della sospensione cellulare tumorale T-antigen-positiva intraperitonealmente in ogni ricevente di topo C57 Black 6 di sei-12 settimane. Per la preparazione degli splenociti bersaglio, posizionare il topo donatore eutanasiato nella posizione prona e spruzzare l'animale con il 70% di etanolo.
Usando forcep e forbici sterili, sollevare la pelle e fare una piccola incisione ventrale della linea mediana. Tagliare la pelle in modo trasversale per esporre il peritoneo e utilizzare le forcep per tirare su il peritoneo in modo simile a una tenda, senza catturare nessuno degli organi interni. Tagliare aprire il peritoneo per esporre la cavità peritoneale e trasferire delicatamente la milza in una smerigliatrice di tessuto Dounce da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS sterile.
Utilizzare lo stantuffo per applicare la pressione manuale fino a quando il tessuto splenico si dissipa in una sospensione cellulare omogenea rossa e trasferire l'omogeneato in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere la sospensione per centrifugazione e rimorsi il pellet in quattro millilitri di tampone di lisina di cloruro di ammonio di potassio per eliminare gli eriociti. Dopo quattro minuti, interrompere il processo con otto millilitri di mezzo completo e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Separare i globuli bianchi dai detriti dei globuli rossi per centrifugazione e rimorsi il pellet in 12 millilitri di mezzo completo. Quindi dividere la sospensione dello splendore in tre aliquote uguali di quattro millilitri. Per la codifica peptidica degli splenociti bersaglio, pulsare un'aliquota di splenocita con un micromolare di peptide irrilevante, un'aliquota con un micromolare di peptide di sito I e un'aliquota con un micromolare di peptide del sito IV per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Alla fine dell'incubazione, rimuovere il peptide in eccesso mediante centrifugazione e lavare gli splenociti pulsati da peptidi due volte in 12 millilitri di PBS sterile e freddo per lavaggio per tubo. Dopo il secondo lavaggio, resuspend le cellule in quattro millilitri di PBS fresco e sterile per tubo. Aggiungere CFSE 025, 0,25 e due micromolari rispettivamente nelle sospensioni irrilevanti, site I e site IV peptide-pulsed splenocyte.
Posizionare i tubi a 37 gradi Celsius per 15 minuti con inversione manuale una volta ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere tre millilitri di siero bovino fetale inattivato dal calore a ciascun tubo per interrompere la reazione CFSE e portare il volume finale in ogni tubo fino a 15 millilitri con PBS. Quindi raccogliere le cellule etichettate coloranti per centrifugazione per due lavaggi in 12 millilitri di PBS fresco e sterile per lavaggio.
Per confermare un'adeguata etichettatura CFSE degli splenociti bersaglio, rimescolare il pellet in tre millilitri di PBS e mescolare con vortici delicati. Trasferire 10 microlitri da ogni sospensione cellulare etichettata CFSE in un singolo smistamento cellulare a fluorescenza rotonda in polistirolo a cinque millilitri, o tubo FACS, contenente PBS, e caricare il tubo su un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nanometri. Nel software del citometro a flusso, creare un cancello di linfocita basato sulle proprietà di dispersione in avanti e dispersione laterale delle cellule prima di acquisire 5.000 eventi che rientrano all'interno del cancello dei linfociti nel canale di Fluorescenza 1.
All'interno della popolazione madre positiva al CFSE, disegnare ulteriori porte dell'istogramma per identificare le sottopopolazioni basse, cfse-intermedie e ad alto CFSE. Quindi confermare un numero di evento uguale o quasi uguale all'interno dei tre gate per gli altri due tubi di celle etichettate. Per l'iniezione delle cellule bersaglio, prima vortice delicatamente i tubi sorgente e mettere in comune le tre sospensioni cellulari etichettate CFSE in un nuovo tubo a parità di rapporti.
Ricaricare il contenuto del tubo con PBS sterile e raccogliere le cellule per centrifugazione per il conteggio. Quindi regolare il volume a uno per 10 alle sette celle bersaglio miste per 200 microlitri di PBS per concentrazione ricevente e iniettare 200 volumi di microlitri della sospensione cellulare nella vena di coda di ogni mouse C57 Black 6 ricevente. Due o quattro ore dopo l'iniezione, rimuovere ed elaborare la milza di ogni animale ricevente come dimostrato e rimpiorsire i globuli bianchi isolati in tre millilitri di PBS per milza.
Trasferire circa una volta 10 alle sette cellule da ogni milza lavorata in un tubo FACS pulito e far funzionare immediatamente le cellule sul citometro di flusso come dimostrato per gateare le popolazioni di cellule bersaglio basse, intermedie e alte del CFSE. Quindi acquisire un totale di 2.000 eventi CFSE-low nel canale Fluorescence 1 e calcolare la lisi specifica di ogni popolazione di cellule bersaglio affini secondo la formula dettagliata nel testo. In questo esperimento rappresentativo, il successo dell'esaurimento delle cellule T regolatorie presenti in natura nei topi iniettati con anticorpo monoclonale anti-CD25 è stato confermato dalla citometria a flusso.
Come previsto, picchi quasi uguali corrispondenti al controllo e alle cellule bersaglio affini erano rilevabili nei topi ingenui. Al contrario, le cellule bersaglio che mostravano site-IV erano quasi completamente assenti nei topi innescati con antigene T, indipendentemente dal loro trattamento precedente con anticorpi monoclonali anti-CD25 o PBS. È interessante notare che l'esaurimento naturale delle cellule reg T da parte di anticorpi monoclonali anti-CD25 ha aumentato in vivo la lisi citotossica mediata da Linfociti T delle cellule bersaglio pulsate site-I.
In questa seconda indagine rappresentativa, il blocco programmato della morte 1 ha migliorato i siti cellulari T sub-dominanti CD8-positivi una e due-barra-tre-specifiche, suggerendo che interferire con le interazioni programmate morte 1/ligando di morte programmata 1 può indurre la diffusione dell'epitopo nelle risposte delle cellule T cd8-positive anti-cancro. È fondamentale quando si etichettano le cellule donatrici con CFSE, assicurarsi che le concentrazioni siano precise. In caso contrario, ciò potrebbe comportare sovrapposizioni di picchi di istogramma, che rendono difficili, se non impossibili, i calcoli richiesti e l'interpretazione dei dati.
Sarà importante ottimizzare i test di citotossicità in vivo per quantificare le funzioni dell'effettore suscitate da diversi tipi di cellule killer che riconoscono antigeni peptidici e non peptidici nello stesso ospite.
