Cet essai peut être employé pour quantifier la cytotoxicité T-cellule- médiatisée contre deux épitopes distincts de peptide des antigènes de tumeur simultanément. La nature in vivo de cet essai permet de mesurer la fonction cytotoxique des lymphocytes T dans l’architecture intacte d’un organe lymphoïde secondaire. En outre, la mise à mort observée est un reflet exact du nombre absolu de cellules T, et pas seulement de leurs fréquences, ce qui peut être trompeur.
Cet essai permet l’examen des réponses cytotoxiques de cellule T aux antigènes immunodominants et sous-dominants de tumeur. Il fournit donc des informations précieuses lors de la conception d’un vaccin, ainsi que des protocoles immunothérapeutiques pour le cancer. Notre protocole a été adapté pour étudier les réponses des lymphocytes T CD8.
Cependant, il peut être modifié pour mesurer la cytotoxicité obtenue par d’autres types de cellules tueuses, telles que les cellules NK et les lymphocytes T innés. Cet essai exige l’expérience dans la technique aseptique, la manipulation de tissu de souris, la préparation de cellules cibles, aussi bien que l’expertise dans des injections de veine de queue. Il faut acquérir cette compétence avant de tenter l’analyse in vivo tuer.
Une fois que la lignée de cellules tumorales adhérentes t-antigène-positives est devenue entièrement confluente ou légèrement surconfluente, rincez doucement le monocouche avec du PBS stérile et chaud, et détachez les cellules tumorales avec 0,25% trypsine EDTA dans une armoire de biosécurité. Appuyez sur les côtés de la torche de culture plusieurs fois pour libérer les cellules adhérentes restantes, et arrêter la réaction après environ cinq minutes avec l’ajout de cinq millilitres de milieu DMEM. Pipette la solution cellulaire à quelques reprises avant de filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres-pores dans un tube conique de 50 millilitres.
Recueillir les cellules par centrifugation, et resuspendre la pastille en 10 millilitres de stérile, froid PBS pour le premier des trois lavages dans les mêmes conditions. Après le troisième lavage, résuspendez les cellules à quatre fois 10 aux sept cellules par millilitre de concentration stérile de PBS, et injectez 500 microlitres de la suspension de cellules tumorales T-antigène-positives intraperitoneally dans chaque destinataire de souris C57 Black 6 de six à 12 semaines. Pour la préparation des splenocytes cibles, placez la souris donneur euthanasié en position couchée et vaporisez l’animal avec 70 % d’éthanol.
À l’aide de forceps et de ciseaux stériles, soulevez la peau et faites une petite incision ventrale à mi-ligne. Coupez la peau d’une manière croisée pour exposer le péritoine, et utilisez les forceps pour tirer vers le haut du péritoine d’une manière de tente-comme, sans attraper aucun des organes internes. Coupez le péritoine pour exposer la cavité péritonéale, et transférez doucement la rate à un broyeur de tissu Dounce de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS stérile.
Utilisez le piston pour appliquer une pression manuelle jusqu’à ce que le tissu splénique se dissipe dans une suspension cellulaire homogène rouge, et transférer l’homogénéité dans un tube de 15 millilitres. Recueillir la suspension par centrifugation, et resuspendre la pastille en quatre millilitres de tampon de lysine de potassium chlorure d’ammonium pour éliminer les érythrocytes. Après quatre minutes, arrêter le processus avec huit millilitres de milieu complet, et filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres-pore dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Séparez les globules blancs des débris des globules rouges par centrifugation, et réutilisez la pastille en 12 millilitres de milieu complet. Ensuite, divisez la suspension des splenocytes en trois aliquots égaux de quatre millilitres. Pour le codage peptidique des splenocytes cibles, pulsez un aliquot splenocyte avec un micromolaire de peptide non pertinent, un aliquot avec un micromolaire de peptide du site I, et un aliquot avec un micromolaire de peptide du site IV pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
À la fin de l’incubation, retirer l’excès de peptide par centrifugation et laver les splenocytes à impulsion peptidique deux fois en 12 millilitres de PBS stérile et froid par lavage par tube. Après le deuxième lavage, resuspendez les cellules en quatre millilitres de PBS frais et stérile par tube. Ajouter 025, 0,25 et cfse à deux micromolaires dans les suspensions de splenocytes peptidiques non pertinentes, le site I et le site IV, respectivement.
Placez les tubes à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes avec inversion manuelle une fois toutes les cinq minutes. À la fin de l’incubation, ajouter trois millilitres de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur à chaque tube pour arrêter la réaction du CFSE et amener le volume final dans chaque tube jusqu’à 15 millilitres avec PBS. Puis recueillir les cellules étiquetées de teinture par centrifugation pour deux lavages dans 12 millilitres de PBS frais et stérile par lavage.
Pour confirmer un étiquetage adéquat de l’ESFC des splenocytes cibles, résuspendez la pastille en trois millilitres de PBS et mélangez-la avec un léger vortex. Transférez 10 microlitres de chaque suspension cellulaire étiquetée CFSE dans un tri cellulaire individuel de cinq millilitres à fond rond activé par fluorescence, ou tube FACS, contenant du PBS, et chargez le tube sur un cytomètre d’écoulement équipé d’un laser à 488 nanomètres. Dans le logiciel de cytomètre d’écoulement, créez une porte de lymphocyte basée sur les propriétés avant de dispersion et de dispersion latérale des cellules avant d’acquérir 5000 événements tombant dans la porte de lymphocyte dans le canal fluorescence 1.
Au sein de la population parente positive à l’ETFC, dessinez d’autres portes d’histogramme pour identifier les sous-populations cfse-faible, cfse-intermédiaire et cfse-high. Ensuite, confirmez un nombre d’événements égal ou presque égal dans les trois portes pour les deux autres tubes de cellules étiquetées. Pour l’injection des cellules cibles, vortexez d’abord doucement les tubes sources et mutualisez les trois suspensions cellulaires étiquetées CFSE dans un nouveau tube à des ratios égaux.
Recharger le contenu du tube avec pbs stérile, et de recueillir les cellules par centrifugation pour le comptage. Ajustez ensuite le volume à un 10 fois aux sept cellules cibles mixtes par 200 microlitres de PBS par concentration de receveur, et injectez 200 volumes de microlitres de la suspension cellulaire dans la veine arrière de chaque souris C57 Black 6. Deux ou quatre heures après l’injection, enlever et traiter la rate de chaque animal receveur tel que démontré, et resuspendre les globules blancs isolés en trois millilitres de PBS par rate.
Transférez environ une fois 10 aux sept cellules de chaque rate traitée dans un tube FACS propre, et exécutez immédiatement les cellules sur le cytomètre d’écoulement comme démontré pour portailr les populations de cellules cibles cfse-basses, intermédiaires et élevées. Ensuite, acquérir un total de 2000 événements cfse-bas dans le canal fluorescence 1, et calculer la lyse spécifique de chaque population de cellules cibles cognées selon la formule détaillée dans le texte. Dans cette expérience représentative, le succès de l’épuisement des lymphocytes T réglementaires naturels chez les souris injectées avec l’anticorps monoclonal anti-CD25 a été confirmé par cytométrie de flux.
Comme prévu, des pics presque égaux correspondant aux cellules cibles témoins et cognées étaient détectables chez les souris naïves. En revanche, les cellules cibles site-IV-affichage étaient presque complètement absentes chez les souris T-antigène-amorcées, indépendamment de leur traitement antérieur avec l’anticorps monoclonal anti-CD25 ou PBS. Fait intéressant, l’épuisement naturel des lymphocytes T par anticorps monoclonal anti-CD25 a augmenté la lyse cytotoxique de T-lymphocyte-médiée par le site-I-pulsé des cellules cibles.
Dans cette deuxième enquête représentative, le blocus programmé de la mort 1 a renforcé les sites de lymphocytes T cd8 positifs sous-dominants une et deux-slash-three-réponses spécifiques, suggérant que l’interférence avec la mort programmée 1/programmée ligand 1 interactions de mort puisse induire l’épitope-propagation dans les réponses anticancéreuses cd8-positives de cellules T. Il est essentiel d’étiqueter vos cellules donneuses avec le CFSE, assurez-vous que vos concentrations sont précises. Dans le cas contraire, cela peut entraîner des pics d’histogramme qui se chevauchent, ce qui rend vos calculs et l’interprétation des données difficiles, voire impossibles.
Il sera important d’optimiser les analyses de cytotoxicité in vivo pour quantifier les fonctions effectrices obtenues par différents types de cellules tueuses qui reconnaissent les antigènes peptidiques et non peptidiques dans le même hôte.
