Bu tsay aynı anda tümör antijenlerinin iki farklı peptit epitoplarına karşı T-hücre aracılı sitotoksisite ölçmek için kullanılabilir. Bu tişin in vivo doğası t-hücrelerinin sitotoksik fonksiyonu ikincil bir lenfoid organın bozulmamış mimarisi içinde ölçülebilir sağlar. Buna ek olarak, gözlenen öldürme T-hücrelerinin mutlak sayısının doğru bir yansıması, ve yanıltıcı olabilir sadece onların frekansları, .
Bu tetki, immündominant ve sub-dominant tümör antijenlerine sitotoksik T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu nedenle bir aşı tasarlarken değerli bilgiler sağlar, yanı sıra kanser için immünoterapötik protokoller. Protokolümüz CD8 T hücre yanıtlarını incelemek için özel olarak tasarlanmıştır.
Ancak, nk hücreleri ve doğuştan t lenfositler gibi diğer katil hücre tipleri tarafından ortaya sitotoksisite ölçmek için değiştirilebilir. Bu töz aseptik tekniği, fare doku işleme, hedef hücre hazırlık, yanı sıra kuyruk ven enjeksiyonları uzmanlık deneyimi gerektirir. Bir in vivo öldürme tsay denemeden önce bu beceri seti elde etmek gerekir.
Bir kez T-antijen-pozitif yapışık tümör hücre hattı tamamen uyumlu veya biraz aşırı confluent haline gelmiştir, hafifçe steril ile monolayer durulayın, sıcak PBS, ve bir biyogüvenlik kabinede% 0.25 tripsin EDTA ile tümör hücreleri ayırmak. Kalan yapışık hücreleri serbest bırakmak için kültür şişesinin kenarlarına birkaç kez dokunun ve beş mililitre DMEM ortamı nın eklenmesiyle yaklaşık beş dakika sonra reaksiyonu durdurun. Pipet hücre çözeltisi hücre çözeltisi 50 mililitrelik konik tüp içine 70 mikrometre-gözenek hücre süzgeci ile hücre süspansiyon filtreleme den önce birkaç kez.
Santrifüj ile hücreleri toplamak ve aynı koşullar altında üç yıkar ilk steril, soğuk PBS 10 mililitre pelet resuspend. Üçüncü yıkamadan sonra, steril PBS konsantrasyonunun mililitre başına yedi hücreye dört kez 10 hücreleri yeniden askıya, ve her altı-12 haftalık C57 Siyah 6 fare alıcıiçine t-antijen-pozitif tümör hücresi süspansiyon intraperitoneally 500 mikrolitre enjekte. Hedef splenosit hazırlama için, ötanazi donör fareyi yatkın konuma getirin ve hayvanı %70 etanol püskürtün.
Steril forseps ve makas kullanarak, cildi kaldırın ve küçük bir ventral orta hat kesi yapmak. Periton ortaya çıkarmak için çapraz bir şekilde deri kesin ve herhangi bir iç organları yakalamadan, bir çadır gibi bir şekilde periton çekmek için çerofma kullanın. Periton boşluğuortaya çıkarmak için periton açık kesin ve hafifçe steril PBS beş mililitre içeren 15 mililitrelik Dounce doku öğütücü için dalak aktarın.
Dalak dokusu kırmızı homojen hücre süspansiyon içine dağılır kadar manuel basınç uygulamak için piston kullanın, ve 15 mililitrelik bir tüp içine homojen transfer. Santrifüj ile süspansiyon toplamak ve eritrositleri ortadan kaldırmak için amonyum klorür potasyum lizin tampon dört mililitre pelet resuspend. Dört dakika sonra, tam orta sekiz mililitre ile işlemi durdurmak ve yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 70 mikrometre-gözenek hücre süzgeç imizle hücre süspansiyon filtre.
Santrifüj ile kırmızı kan hücresi enkaz beyaz kan hücreleri ayırın ve tam orta 12 mililitre pelet resuspend. Sonra splenosit süspansiyon üç eşit dört mililitre aliquots bölün. Hedef splenositlerin peptid kodlaması için, alakasız peptid bir mikromolar ile nabız bir splenosit aliquot, Site I peptid bir mikromolar ile bir aliquot, ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir saat için Site IV peptid bir mikromolar ile bir aliquot.
Kuluçka sonunda, santrifüj ile aşırı peptid kaldırmak ve steril 12 mililitre iki kez peptid-pulsed splenosityıkamak, tüp başına yıkama başına soğuk PBS. İkinci yıkamadan sonra, tüp başına taze, steril PBS dört mililitre hücreleri yeniden askıya. Alakasız, Site I ve Site IV peptid darbeli splenosit süspansiyonları sırasıyla içine 025, 0,25 ve iki mikromolar CFSE ekleyin.
Tüpleri her beş dakikada bir manuel ters çevirme ile 15 dakika boyunca 37 derecede yerleştirin. Kuluçka sonunda, CFSE reaksiyonunu durdurmak ve pbs ile 15 mililitreye kadar her tüpte son hacmi getirmek için her tüpe üç mililitre ısı-inaktive fetal sığır serumu ekleyin. Daha sonra yıkama başına taze, steril PBS 12 mililitre iki yıkar için santrifüj tarafından boya etiketli hücreleri toplamak.
Hedef splenositlerin yeterli CFSE etiketini onaylamak için, pBS'nin üç mililitresinde peleti yeniden askıya alın ve nazik girdaplarla karıştırın. Her CFSE etiketli hücre süspansiyonundan 10 mikrolitreyi tek bir beş mililitrelik yuvarlak alt polistiren floresan aktif hücre sıralamasına veya PBS içeren FACS tüpüne aktarın ve tüpü 488 nanometre lazerle donatılmış bir akış sitometresine yükleyin. Akış sitometre yazılımında, Flüoresans 1 kanalında lenfosit kapısı içine düşen 5,000 olay elde etmeden önce hücrelerin ileri dağılım ve yan dağılım özelliklerine dayalı bir lenfosit kapısı oluşturun.
Üst CFSE-pozitif popülasyon içinde, CFSE-düşük, CFSE-orta ve CFSE-yüksek alt popülasyonları tanımlamak için ek histogram kapıları çizin. Ardından, etiketli hücrelerin diğer iki tüpü için üç kapı içinde eşit veya neredeyse eşit olay numarasını onaylayın. Hedef hücrelerin enjeksiyonu için, ilk olarak kaynak tüplerini yavaşça girdaplayın ve üç CFSE etiketli hücre süspansiyonlarını eşit oranlarda yeni bir tüpe yerleştirin.
Steril PBS ile tüp içeriğini toplayın ve saymak için santrifüj ile hücreleri toplamak. Daha sonra sesi alıcı konsantrasyonu başına 200 mikrolitre PBS başına yedi karışık hedef hücreye 10 kez ayarlayın ve her alıcıc57 Black 6 farenin kuyruk damarına hücre süspansiyonunun 200 mikrolitre lik hacimlerini enjekte edin. Enjeksiyondan iki ya da dört saat sonra, her alıcı hayvanın dalağını gösterildiği gibi çıkarın ve işlenin ve dalak başına üç mililitre PBS'de izole edilmiş beyaz kan hücrelerini yeniden askıya alın.
Her işlenmiş dalaktan temiz bir FACS tüpüne yaklaşık bir kez 10 hücre aktarın ve CFSE-düşük, orta ve yüksek hedef hücre popülasyonlarına geçit vermek için gösterildiği gibi akış sitometresindeki hücreleri hemen çalıştırın. Daha sonra Floresan 1 kanalında toplam 2.000 CFSE-düşük olay elde edin ve metinde ayrıntılı formüle göre her cognate hedef hücre popülasyonunun spesifik lysis'ini hesaplayın. Bu temsili deneyde, anti-CD25 monoklonal antikor enjekte farelerde doğal olarak oluşan düzenleyici T-hücrelerinin tükenmesinin başarısı akış sitometrisi ile doğrulandı.
Beklendiği gibi, kontrol ve biliş hedef hücrelerine karşılık gelen neredeyse eşit zirveler naif farelerde tespit edildi. Buna karşılık, Site-IV-görüntüleme hedef hücreleri neredeyse tamamen T-antijen-astarlı farelerde yoktu, ne olursa olsun anti-CD25 monoklonal antikor veya PBS ile önceki tedavi. İlginçtir, anti-CD25 monoklonal antikor tarafından doğal olarak meydana gelen T reg hücre tükenmesi site-I-darbeli hedef hücrelerin in vivo sitotoksik T-lenfosit aracılı lysis artırılmış.
Bu ikinci temsili araştırmada, programlanmış ölüm 1 abluka gelişmiş alt-dominant CD8-pozitif T hücre siteleri bir ve iki-slash-üç-spesifik yanıtlar, programlanmış ölüm 1/programlı ölüm ligand 1 etkileşimleri ile müdahale anti-kanser CD8-pozitif T hücre yanıtlarında epitop-yayılma neden olabileceğini düşündürmektedir. Donör hücrelerinizi CFSE ile etiketlerken çok önemlidir, konsantrasyonlarınızın kesin olduğundan emin olun. Aksi takdirde bu, gerekli hesaplamalarınızı ve veri yorumunuzu imkansız olmasa da zorlaştıran histogram zirvelerinin çakışmasıyla sonuçlanabilir.
Aynı konakta peptit ve peptit olmayan antijenleri tanıyan farklı öldürücü hücre tipleri tarafından ortaya çıkan efektör fonksiyonları ölçmek için in vivo sitotoksisite tahlillerini optimize etmek önemli olacaktır.
