このアッセイは、腫瘍抗原の2つの異なるペプチドエピトープに対するT細胞介在細胞傷害性を同時に定量するために使用することができる。このアッセイのin vivoの性質により、T細胞の細胞傷害機能を二次リンパ器官の無傷のアーキテクチャ内で測定することができます。さらに、観察された殺死は、その頻度だけでなく、T細胞の絶対数を正確に反映しており、誤解を招く可能性があります。
このアッセイは、免疫支配性およびサブドミナント腫瘍抗原に対する細胞傷害性T細胞応答の検査を可能にする。したがって、ワクチンを設計する際に貴重な情報を提供し、がんの免疫療法プロトコルを提供します。私達のプロトコルはCD8 T細胞応答を研究するために合わせられた。
しかし、NK細胞や先天性Tリンパ球などの他のキラー細胞タイプによって引き起こされる細胞毒性を測定するように改変することができる。このアッセイは、無菌技術、マウス組織処理、標的細胞準備、ならびに尾静脈注射の専門知識の経験を必要とする。インビボ殺しアッセイを試みる前に、このスキルセットを取得する必要があります。
T抗原陽性付着性腫瘍細胞株が完全にコンフルまたはわずかに過剰にコンフルエントになったら、滅菌、温かいPBSで単層を穏やかにすすい、バイオセーフティキャビネット内の0.25%トリプシンEDTAで腫瘍細胞を取り外します。培養フラスコの側面を数回タップして残存細胞を放出し、5ミリリットルのDMEM培地を添加して約5分後に反応を停止させた。70マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐チューブに細胞懸濁液を濾過する前に、細胞溶液を数回ピペット。
遠心分離によって細胞を収集し、同じ条件下で3回の最初の滅菌、冷たいPBSの10ミリリットルでペレットを再懸濁する。3回目の洗浄後、細胞を無菌PBS濃度のミリリットル当たり7個の細胞に4倍10回再懸濁し、6~12週齢のC57ブラック6マウスレシピエントのそれぞれに腹腔内に500マイクロリットルのT抗原陽性腫瘍細胞懸濁液を注入する。標的脾細胞製剤の場合は、安楽死させたドナーマウスを起こしやすい位置に置き、動物に70%エタノールを噴霧する。
無菌鉗子とはさみを使用して、皮膚を持ち上げ、小さな腹側正線切開を行います。腹骨を露出させるために十字架のような方法で皮膚をカットし、内臓のいずれかをキャッチすることなく、テントのような方法で腹部を引き上げるために鉗子を使用しています。腹膜を切り開いて腹腔を露出させ、5ミリリットルの無菌PBSを含む15ミリリットルのダウンス組織粉砕機に脾臓を穏やかに移す。
プランジャーを使用して、脾臓組織が赤い均質な細胞懸濁液に消散するまで手動圧力をかけ、ホモゲン酸を15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離によって懸濁液を回収し、赤血球を排除するために塩化アンモニウムリシンバッファーの4ミリリットルでペレットを再懸濁します。4分後、8ミリリットルの完全な培地でプロセスを停止し、70マイクロメートル孔細胞ストレーナーを介して新しい50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を濾過します。
遠心分離によって赤血球の破片から白血球を分離し、完全な培地の12ミリリットルでペレットを再懸濁する。その後、脾細胞懸濁液を3つの等しい4ミリリットルのアリコートに分割する。標的脾細胞のペプチドコードの場合、無関係なペプチドの1つのマイクロモル、サイトIペプチドの1つのマイクロモルを持つ1つのアリコート、および37°Cと5%の二酸化炭素で1時間のサイトIVペプチドの1つのマイクロモルを持つ1つのアリコートを1つの脾細胞アリコートをパルスする。
インキュベーションの終わりに、遠心分離によって余分なペプチドを除去し、ペプチドパルス脾細胞を12ミリリットルの滅菌で2回洗浄し、1回の洗浄1回の冷たいPBSを洗浄する。2回目の洗浄後、チューブ当たりの新鮮な無菌PBSの4ミリリットルで細胞を再懸濁する。025、0.25、および2マイクロモルCFSEを無関係な部位Iおよび部位IVペプチドパルス脾細胞懸濁液にそれぞれ加える。
5分に1回手動反転で15分間、37°Cでチューブを置きます。インキュベーションの終わりに、各チューブに熱不活化胎児ウシ血清3ミリリットルを加えてCFSE反応を停止し、各チューブの最終体積をPBSで最大15ミリリットルにします。次に、1回の洗浄ごとに12ミリリットルの新鮮な無菌PBSで2回の洗浄に対して遠心分離によって色素標識細胞を収集します。
標的脾細胞の適切なCFSE標識を確認するために、PBSの3ミリリットルでペレットを再懸濁し、穏やかな渦と混合する。各CFSE標識された細胞懸濁液から10マイクロリットルを、PBSを含む個々の5ミリリットルの丸いポリステイン・ポリステレン・アクティベート・セル・ソーティング、またはFACSチューブに移し、488ナノメートルのレーザーを搭載したフローサイトメーターにチューブをロードします。フローサイトメーターソフトウェアでは、蛍光1チャネルのリンパ球ゲート内に5,000個の事象を獲得する前に、細胞の前方散乱および側面散乱特性に基づいてリンパ球ゲートを作成します。
親 CFSE 陽性母集団内で、追加のヒストグラム・ゲートを描画して、CFSE 低、CFSE 中間、および CFSE 高のサブ人口を識別します。次に、ラベル付きセルの他の 2 つのチューブについて、3 つのゲート内で等しいイベント番号またはほぼ等しいイベント番号を確認します。ターゲット細胞の注入の場合、まずソースチューブを穏やかに渦を流し、3つのCFSE標識細胞懸濁液を等しい比率で新しいチューブにプールします。
チューブの内容物を無菌PBSで上げ、カウント用遠心分離によって細胞を収集します。次に、レシピエント濃度あたり200マイクロリットル当たり7個の混合標的細胞に10倍の体積を調整し、各レシピエントC57 Black6マウスの尾静脈に細胞懸濁液の200マイクロリットル量を注入する。注射の2〜4時間後、各レシピエント動物の脾臓を除去して処理し、脾臓当たり3ミリリットルのPBSで単離した白血球を再中断する。
各処理された脾臓から7つの細胞に約10回を清浄なFACSチューブに移し、CFSE低、中間、および高ターゲット細胞集団をゲートするように示すように、フローサイトメーター上の細胞をすぐに実行します。次に、蛍光1チャネルで合計2,000 CFSE低イベントを取得し、テキストに詳述された式に従って各同種標的細胞集団の特異的なリシスを計算する。本代表的実験では、抗CD25モノクローナル抗体を注射したマウスにおける天然の調節性T細胞の枯渇の成功がフローサイトメトリーによって確認された。
予想通り、対照および同結合標的細胞に対応するほぼ等しいピークは、ナイーブマウスで検出可能であった。対照的に、サイト-IVディスプレイ標的細胞は、抗CD25モノクローナル抗体またはPBSによる前処理に関係なく、T-抗原プライミングマウスにほぼ完全に存在しなかった。興味深いことに、インビボ細胞傷害性Tリンパ球媒介性標的細胞の抗CD25モノクローナル抗体による天然のT reg細胞枯渇。
この2番目の代表的な調査では、プログラムされた死1遮断は、サブ支配的なCD8陽性T細胞部位1および2スラッシュ3特異的応答を強化し、プログラムされた死1/プログラム死リガンド1相互作用を妨害すると、抗癌CD8陽性T細胞応答におけるエピトープ拡散を誘発する可能性があることを示唆している。ドナー細胞にCFSEでラベリングをする際には、濃度が正確であることを確認することが重要です。そうしないと、ヒストグラムのピークが重なり合う可能性があり、必要な計算やデータ解釈が困難になる可能性があります。
同じ宿主内のペプチドおよび非ペプチド抗原を認識する異なるキラー細胞型によって引き出されるエフェクター機能を定量化するために、生体内細胞毒性アッセイを最適化することが重要です。
