Nosso modelo de bexiga com um músculo detrusor removido é uma nova abordagem experimental para estudar simultaneamente a disponibilidade de mediadores uroteliais na propria lamia e lúmen da bexiga durante o preenchimento da bexiga. Este modelo pode fornecer novas percepções sobre os mecanismos de sinalização entre urotélio, suburotélio e músculo detrusor que regulam a excitabilidade da bexiga durante o preenchimento. Comece colocando a amostra intacta da bexiga murina em um prato de dissecação sob um microscópio de dissecção contendo 10 graus celsius de KBS oxigenados e limpando os tecidos conjuntivos e gordos ao redor da bexiga.
Fixe uma pequena porção da cúpula da bexiga isolada por todo o caminho através da borda mais externa do músculo detrusor longe da borda mais interna do músculo que enfrenta o suburotélio lamia propria para um prato de dissecação coberto sylgard cheio de KBS, e fixar os ureteres e pescoço da bexiga para exibir a preparação intacta da bexiga. Usando fórceps finos, puxe suavemente um pedaço da serosa no canto entre o ureter e o corpo da bexiga e ajuste a luz do microscópio para aumentar a transparência e distinguir a margem da submucosa sob o músculo detrusor. Para evitar perfurar a parede de preparação, certifique-se de cortar o músculo detrusor apenas enquanto a borda lateral da mucosa da bexiga é claramente visível.
Usando uma tesoura de ponta fina, comece a cortar a parede da bexiga ao longo da superfície interna da camada muscular detrusor enquanto puxa suavemente o segmento de corte para longe da preparação, tomando cuidado para que a borda lateral da mucosa possa ser observada evitando tocar na borda do tecido. Deixe um pequeno pedaço do músculo detrusor em cima da cúpula da bexiga para permitir que a preparação seja imobilizada durante as etapas restantes do protocolo e encha uma peça de dois centímetros de tubos de polietileno com KBS oxigenados de 37 graus celsius. Depois de inserir o cateter no orifício da uretra da bexiga, empurre suavemente o cateter até que a ponta do cateter atinja o meio aproximado da bexiga.
Em seguida, fixe o cateter no tecido circundante do pescoço da bexiga com uma sutura de nylon de 6,0 laços duplos. Depois de verificar se há vazamentos no tecido, coloque a preparação da bexiga desnudada em uma câmara de três mililitros de 37 graus celsius com um fundo sylgard e fixe o cateter ao lado da câmara para que a preparação não flutue acima da superfície da solução de perfusão. Conecte o cateter da bexiga a um pedaço de tubo de polietileno 20 conectado a uma torneira de três vias e uma seringa de infusão preenchida com KBS oxigenados de 37 graus celsius e inicie a bomba de infusão para encher a bexiga com KBS tomando cuidado para monitorar o volume de enchimento na pressão intravesical durante o enchimento.
Para detectar mediadores dentro do aspecto suburotélio lamina propria da preparação, colete alíquotas da solução de banho em vários pontos de tempo experimentais apropriados e processe as amostras de acordo com a análise planejada a jusante. A parede de preparação da bexiga desnudada contém o urotélio e o suburotélio, mas não o músculo liso destrusor. As relações de volume de pressão são notavelmente semelhantes nos preparativos intactos e desnudos.
A adequação do modelo para medir mediadores derivados do urotélio que são liberados no lado suburothelium lamina propria durante o enchimento pode ser testada medindo a liberação de mediadores de purina na solução que banha a suburothelium lamina propria da preparação desnudada. Como demonstrado, quantidades insignificantes de purinas podem ser detectadas em um banho contendo uma preparação isolada da bexiga com um músculo detrusor intacto;enquanto as quantidades dessas purinas são significativamente maiores em amostras coletadas do banho contendo uma preparação desnudada da bexiga. Notavelmente, a distribuição de purinas e metabólitos em amostras coletadas do lúmen e da suburothelium lamina propria no final do enchimento difere significativamente.
A adição do ATP de Atheno, um análogo altamente fluorescente da ATP, ao lado suburotelial da preparação sem detrusor resulta em uma diminuição no ATP de Atenas e um aumento nos produtos da ATP de Atheno, Atheno ADP, Atheno AMP e Atheno ADO. Da mesma forma, a adição do ATP de Atheno à preparação do lúmen resulta em uma diminuição no ATP de Atheno e um aumento no Atheno ADP, Atheno AMP e Atheno ADO no lúmen. Além disso, a adição do ATP de Atheno ao lado suburothelium lamina propria da preparação desnudada resulta no aparecimento de ATHENO AMP e Atheno ADO dentro do lúmen.
Da mesma forma, adicionar ATP de Atenas ao lúmen resulta no aparecimento de Atheno AMP e Atheno ADO na suburothelium lamina propria. Após este procedimento, a disponibilidade de mediadores excitatórios e inibitórios pode ser medida na álmina propria e no lúmen da bexiga em diferentes estágios de enchimento da bexiga. O transporte transuretral bilateral de mediadores e o metabolismo dos mediadores também podem ser estudados utilizando esse modelo.
O uso deste novo modelo de bexiga resultará em uma nova compreensão da sinalização mecanosensível local entre o urotélio e o músculo liso destrusor que controlam a excitabilidade da bexiga na saúde e na doença.
