Il nostro modello di vescica con un muscolo detrusore rimosso è un nuovo approccio sperimentale per studiare contemporaneamente la disponibilità di mediatori uroteliali nella lamia propria e nel lume vescicale durante il riempimento della vescica. Questo modello può fornire nuove informazioni sui meccanismi di segnalazione tra urotelio, suburotelio e muscolo detrusore che regolano l'eccitabilità della vescica durante il riempimento. Iniziare posizionando l'esemplare di vescica murina intatto in un piatto sezionante sotto un microscopio a dissezione contenente KBS ossigenato di 10 gradi celsius e pulendo i tessuti connettivi e grassi intorno alla vescica.
Pin una piccola porzione della cupola della vescica isolata fino attraverso il bordo più esterno del muscolo detrusore lontano dal bordo più interno del muscolo che si affaccia sul suburotelio lamia propria a un piatto di sezionamento coperto di sylgard riempito con KBS, e fissare gli ureteri e il collo della vescica per mostrare la preparazione della vescica intatta. Utilizzando forcelle a punta fine, tirare delicatamente un pezzo di serosa all'angolo tra l'uretro e il corpo della vescica e regolare la luce del microscopio per aumentare la trasparenza e distinguere il margine della sottomucosa sotto il muscolo detrusore. Per evitare di perforare la parete di preparazione, assicurarsi di tagliare il muscolo detrusore solo mentre il bordo laterale della mucosa vescicale è chiaramente visibile.
Utilizzando forbici a punta fine, iniziare a tagliare la parete della vescica lungo la superficie interna dello strato muscolare del detrusore mentre si allontana delicatamente il segmento tagliato dalla preparazione facendo attenzione che il bordo laterale della mucosa possa essere osservato evitando di toccare il bordo del tessuto. Lasciare un piccolo pezzo del muscolo detrusore sopra la cupola della vescica per consentire l'immobilizzazione della preparazione durante i restanti passaggi del protocollo e riempire un pezzo di due centimetri di tubi in polietilene da 20 centimetri con KBS ossigenato celsius di 37 gradi celsius. Dopo aver inserito il catetere nell'orifizio dell'uretra vescica, spingere delicatamente il catetere fino a quando la punta del catetere raggiunge il centro approssimativo della vescica.
Quindi fissare il catetere nel tessuto circostante del collo della vescica con una sutura in nylon 6.0 a doppio anello. Dopo aver controllato la presenza di perdite nel tessuto, posizionare la preparazione della vescica denudata in una camera da tre millilitri di 37 gradi Celsius con un fondo sylgard e fissare il catetere sul lato della camera in modo che la preparazione non galleggi sopra la superficie della soluzione di perfusione. Collegare il catetere della vescica a un pezzo di tubo di polietilene 20 collegato a un fermafo a tre e una siringa per infusione riempita con KBS ossigenato di 37 gradi celsius e avviare la pompa di infusione per riempire la vescica con KBS facendo attenzione a monitorare il volume di riempimento nella pressione intravesica durante il riempimento.
Per rilevare i mediatori all'interno dell'aspetto suburotelio lamina propria della preparazione, raccogliere le aliquote della soluzione del bagno in vari punti di tempo sperimentali appropriati ed elaborare i campioni secondo l'analisi a valle pianificata. La parete di preparazione della vescica denudata contiene l'urotelio e il suburotelio ma non il muscolo liscio detrusore. Le relazioni di volume di pressione sono notevolmente simili nei preparati intatti e denudati.
L'idoneità del modello per la misurazione dei mediatori derivati dall'urotelio rilasciati nel lato suburotelio lamina propria durante il riempimento può essere testata misurando il rilascio di mediatori purini nella soluzione che bagna il suburotelio lamina propria del preparato denudato. Come dimostrato, quantità trascurabili di purine possono essere rilevate in un bagno contenente una preparazione isolata della vescica con un muscolo detrusore intatto;mentre le quantità di queste purine sono significativamente più elevate nei campioni raccolti dal bagno contenenti una preparazione della vescica denudata. In particolare, la distribuzione di purine e metaboliti in campioni raccolti dal lume e dal suburotelio lamina propria al termine del riempimento differisce in modo significativo.
L'aggiunta di atheno ATP, un analogo altamente fluorescente dell'ATP, al lato suburoteliale della preparazione senza detrusore comporta una diminuzione dell'atheno ATP e un aumento dei prodotti Atheno ATP, atheno ADP, atheno AMP e atheno ADO. Allo stesso modo, l'aggiunta di atheno ATP alla preparazione del lume si traduce in una diminuzione dell'Atheno ATP e in un aumento dell'ADP ateo, dell'atheno AMP e dell'atheno ADO nel lume. Inoltre, l'aggiunta di atheno ATP al lato suburotelio lamina propria del preparato denudato comporta la comparsa di atheno AMP e atheno ADO all'interno del lume.
Allo stesso modo, l'aggiunta di atheno ATP al lume comporta la comparsa di atheno AMP e atheno ADO nel suburotelio lamina propria. Seguendo questa procedura, la disponibilità di mediatori eccitatori e inibitori può essere misurata alla lamina propria e nella lucentezza della vescica in diverse fasi del riempimento della vescica. Anche il trasporto bilaterale transuretrale di mediatori e il metabolismo dei mediatori possono essere studiati utilizzando questo modello.
L'uso di questo nuovo modello di vescica si tradurrà in una nuova comprensione della segnalazione meccanosensibile intrinseca e locale tra l'urotelio e il muscolo liscio detrusore che controllano l'eccitabilità della vescica in salute e malattia.
