Unser Blasenmodell mit einem entfernten Detrusormuskel ist ein neuer experimenteller Ansatz, um gleichzeitig die Verfügbarkeit von urotheliaalen Mediatoren in der Lamia propria und Blasenlumen während der Blasenfüllung zu untersuchen. Dieses Modell kann neue Einblicke in die Signalmechanismen zwischen Urothelum, Suburothelium und Detrusormuskel geben, die die Blasenerregbarkeit während der Füllung regulieren. Beginnen Sie, indem Sie die intakte murine Blasenprobe in eine Sezierschale unter einem Seziermikroskop mit 10 Grad Celsius sauerstoffhaltigem KBS legen und das Bindemittel- und Fettgewebe um die Blase reinigen.
Stecken Sie einen kleinen Teil der Kuppel der isolierten Blase den ganzen Weg durch den äußersten Rand des Detrusormuskels weit weg vom innersten Rand des Muskels, der dem Suburothelium lamia propria gegenübersteht, zu einer mit KBS gefüllten Sylgard-Dissektierungsschale und heften Sie die Harnleiter und den Blasenhals an, um das intakte Blasenpräparat anzuzeigen. Mit feinspitzen Zangen ziehen Sie vorsichtig ein Stück des Serosa an der Ecke zwischen Harnleiter und Blasenkörper und passen Sie das Licht des Mikroskops an, um die Transparenz zu erhöhen und den Rand der Submucosa unter dem Detrusormuskel zu unterscheiden. Um zu vermeiden, dass die Präparationswand perforiert wird, schneiden Sie den Detrusormuskel nur ab, während der seitliche Rand der Blasenschleimhaut deutlich sichtbar ist.
Mit einer feingekippten Schere beginnen Sie, die Blasenwand entlang der Innenfläche der Detrusor-Muskelschicht zu schneiden, während Sie das geschnittene Segment sanft von der Zubereitung wegziehen, wobei Darauf zu achten ist, dass die seitliche Kante der Schleimhaut beobachtet werden kann, ohne den Rand des Gewebes zu berühren. Lassen Sie ein kleines Stück des Detrusormuskels auf der Oberseite der Blasenkuppel, damit die Vorbereitung während der verbleibenden Schritte des Protokolls immobilisiert werden kann, und füllen Sie ein zwei Zentimeter großes Stück 20 Polyethylenschläuche mit 37 Grad Celsius sauerstoffhaltigem KBS. Nach dem Einsetzen des Katheters in die Öffnung der Harnröhre der Blase drücken Sie den Katheter vorsichtig, bis die Katheterspitze die ungefähre Mitte der Blase erreicht.
Dann sichern Sie den Katheter im umgebenden Gewebe des Blasenhalses mit einer Doppelschlaufe 6.0 Nylon Naht. Nach der Überprüfung des Gewebes auf Leckagen, legen Sie die denuded Blase Vorbereitung in eine Drei-Milliliter-Kammer von 37 Grad Celsius Wasser gemantelte Organschale mit einem Sylgard Boden und sichern Sie den Katheter an der Seite der Kammer, so dass das Präparat nicht über der Oberfläche der Perfusionslösung schwebt. Schließen Sie den Blasenkatheter an ein Stück Polyethylen 20-Schläuche an, die mit einem Drei-Wege-Stopphahn und einer mit 37 Grad Celsius sauerstoffhaltigen KBS gefüllten Infusionsspritze verbunden sind, und starten Sie die Infusionspumpe, um die Blase zu füllen, wobei KBS darauf achtet, das Füllvolumen im intravesischen Druck während der Füllung zu überwachen.
Um Mediatoren innerhalb des Suburothelium lamina propria Aspekts der Zubereitung zu erkennen, sammeln Aliquots der Badlösung zu verschiedenen geeigneten versuchsweisen Zeitpunkten und verarbeiten die Proben gemäß der geplanten nachgelagerten Analyse. Die denuded Blase Vorbereitung Wand enthält das Urothel und Suburothelium, aber nicht Detrusor glatten Muskel. Die Druckvolumenbeziehungen sind in den intakten und denuded Präparaten bemerkenswert ähnlich.
Die Eignung des Modells zur Messung von Urothelium-abgeleiteten Mediatoren, die während der Füllung in der Suburothelium lamina propria-Seite freigesetzt werden, kann durch Messung der Freisetzung von Purinmediatoren in die Lösung getestet werden, die die Suburothelium lamina propria der denudierten Zubereitung badet. Wie gezeigt, können vernachlässigbare Mengen an Purinen in einem Bad nachgewiesen werden, das ein isoliertes Blasenpräparat mit einem intakten Detrusormuskel enthält; während die Mengen dieser Purine in Proben, die aus dem Bad mit einem denuded Blasenpräparat entnommen werden, signifikant höher sind. Insbesondere die Verteilung von Purinen und Metaboliten in Proben, die aus dem Lumen und dem Suburothelium lamina propria am Ende der Füllung entnommen wurden, unterscheiden sich erheblich.
Die Zugabe von atheno ATP, einem hochfluoreszierenden Analogon von ATP, zur suburotheliale Seite der detrusorfreien Zubereitung führt zu einer Abnahme der atheno ATP und einer Zunahme der atheno ATP-Produkte, atheno ADP, atheno AMP und atheno ADO. Ebenso führt die Zugabe von atheno ATP zur Lumenzubereitung zu einer Abnahme des Atheno ATP und zu einer Zunahme von atheno ADP, atheno AMP und atheno ADO im Lumen. Weiterhin führt die Zugabe von Atheno ATP zur Suburothelium lamina propria Seite der denuded Vorbereitung in das Auftreten von Atheno AMP und Atheno ADO innerhalb des Lumens.
Ebenso führt die Zugabe von Atheno ATP zum Lumen zum Auftreten von Atheno AMP und Atheno ADO in der Suburothelium lamina propria. Nach diesem Verfahren kann die Verfügbarkeit von erregenden und hemmenden Mediatoren an der Lamina propria und im Blasenlumen in verschiedenen Stadien der Blasenfüllung gemessen werden. Mit diesem Modell kann auch der bilaterale transurethrale Transport von Mediatoren und der Stoffwechsel von Mediatoren untersucht werden.
Die Verwendung dieses neuen Blasenmodells wird zu einem neuen Verständnis der intrinsischen, lokalen mechanosensitiven Signalisierung zwischen dem Urothel und dem detrusor glatten Muskel führen, die Blasenerregbarkeit bei Gesundheit und Krankheit steuern.
