Este protocolo fornece uma base para a expansão das células tumorais que, por sua vez, permite um estudo aprofundado da função celular tumoral e estados genômicos. Além disso, fornece um sistema de modelo in vitro para avaliar o impacto do tumor na resposta imune. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um protocolo baseado para estabelecer linhas de tumores mesotélios a partir do tecido do paciente.
No momento, não há um protocolo padronizado para este sistema de modelos. O aspecto mais difícil desta técnica é a presença de contaminação do fibroblasto em culturas de passagem precoce. É fundamental ter uma compreensão sólida dos fibroblastos versus morfologia das células tumorais para determinar se as tentativas de fome do fibroblasto estão funcionando.
Comece transferindo 10 mililitros de tumor digerindo coquetel enzimático para um tubo de dissociação. Transfira o pedaço de tecido tumoral para uma tampa de placa estéril de seis poços usando um bisturi estéril. Remova todos os tecidos necróticos gordurosos e coágulos sanguíneos usando um novo bisturi estéril e fórceps.
Corte todo o tecido tumoral em um pequeno fragmento cúbico. Para garantir que o tecido não seque, adicione 500 microliters da solução de Sal Balanceado estéril hank, ou HBSS, ao tecido tumoral. Transfira fragmentos tumorais para o tubo de dissociação contendo 10 mililitros de coquetel enzimático de digestão tumoral.
Feche o tubo firmemente. Coloque-o de lado para baixo sobre o dissociador do tecido e forneça calor ao dissociador. Selecione a configuração pré-programada no dissociador para a configuração do kit de dissociação do tumor humano de 37 graus Celsius e verifique o estado após 10 minutos para garantir que nenhum erro de entupimento seja indicado pela luz vermelha piscando.
Após uma hora, remova o tubo de dissociação e coloque-o em um capô de fluxo laminar. Filtre o tumor digerido colocando um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros e tubos do tumor digerido usando uma pipeta de 10 mililitros no filtro. Se o filtro obstruír, mude para um novo filtro.
Enxágüe o tubo de dissociação com 10 mililitros de mídia de digestão de tumores frescos e lave através do filtro. Remova e descarte o filtro. Leve o volume total para 40 mililitros com o meio de digestão do tumor.
Centrifugar a 500 x g por cinco minutos em temperatura ambiente. Usando uma pipeta aspiradora de dois mililitros presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernaente sem perturbar a pelota e resuspenque as células usando 10 mililitros de meio tumor estéril. Então, novamente, centrifugar os tubos e aspirar o supernante como demonstrado.
Em seguida, resuspenque as células em três mililitros de meio tumor estéril e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa estéril de seis poços. Mantenha a placa em uma incubadora a 37 graus com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, transfira o meio usado do tumor digerido em um poço para um novo poço na mesma placa de seis poços, em seguida, adicione três mililitros de tumor estéril médio para bem um.
Usando um microscópio de fase invertida, determine a porcentagem de contaminação de fibroblastos na cultura de passagem precoce. Se a contaminação dos fibroblastos for superior a 20% das células na cultura de passagem precoce, continue a cultivar após substituir o meio tumoral pelo meio sérico reduzido. Se a população de fibroblasto não for reduzida a 10% ou menos, enxágue suavemente o poço com PBS para remover o soro médio contendo.
Adicione um mililitro de trippsina por poço em uma placa de seis poços. Coloque a placa de seis poços ou o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius por um minuto. Remova a placa ou o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido.
Quando as células estiverem parcialmente levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e tente apenas. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo. Repita o trypsinizante até que haja três a quatro frações removidas.
Centrifugar todas as frações independentes a 500 x g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Usando uma pipeta aspiradora de dois mililitros presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernatante sem perturbar a pelota. Resuspend as células usando cinco mililitros de meio sérico reduzido estéril.
Plaque as células em um frasco T-25 para cada fração e coloque os frascos em uma incubadora a 37 graus Celsius. Para criopreservação de células de passagem precoce, descongele um tubo de meio de congelamento aliquoted. Colete as células por experimentação, primeiro lavando a placa com PBS e adicionando trippsina como demonstrado anteriormente.
Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius por três minutos. Remova o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e a trippsina.
Coloque as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo. Misture o conteúdo do tubo por pipetar suavemente. Remova 20 microliters de suspensão celular para contagem.
Em seguida, centrifufique a suspensão restante da célula a 500 x g por cinco minutos em temperatura ambiente. Quando as células estiverem girando, conte usando um protocolo de contagem específico de laboratório, como azul trypan ou iodeto de laranja/propídio de acridina. Resuspengue as células após a centrifugação em meio congelado com um mínimo de 5 x 10 para a sexta células por mililitro de meio congelado e transfira um mililitro desta suspensão celular para 1,5 mililitro pré-rotulado de criovials.
Coloque os criovias em uma câmara de congelamento de taxa controlada e transfira-os imediatamente para menos 80 graus Celsius. O número mostra uma contaminação crescente de fibras de 80%50% e 30% em comparação com uma cultura sem contaminação por fibroblastos. Esta figura mostra a coloração representativa da superfície da citometria de fluxo de quatro linhas primárias de tumores de mesotelioma, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H e uma linha de tumor de melanoma, MEL526 como controle negativo.
Estas linhas de celular podem expressar tanto mesothelin quanto N-cadherin. A importância de testar o impacto do descolamento enzimático na expressão do marcador de proteína superficial também é mostrada como tanto a trippsina quanto a mistura de colagenase protease resultou na perda da expressão superficial de N-cadherin, enquanto o CD90 não foi impactado. Passos importantes incluem o processamento adequado do tumor, incluindo a remoção de sangue e gordura antes da digestão, identificar a contaminação do fibroblasto e determinar como limitar o crescimento excessivo do fibroblasto é vital.
Um método importante após este procedimento inclui ensaios de linfócito citotóxico para testar a capacidade das células T autólogas de reconhecer células tumorais derivadas do paciente. Esta técnica identificará novos receptores de células T anti-tumores que podem ser de importância terapêutica. Além disso, nos permitirá estudar a interação entre tumor e tumor emparelhado infiltrando linfócitos e disfunção imunológica.
