Este protocolo é significativo porque a presença de células-tronco cancerígenas pode estar associada a recaídas ou um desfecho ruim após a radioterapia. Estudar as células-tronco radioresistantes pode fornecer pistas para superar a radioresistância. Nesta técnica, as células-tronco cancerígenas são salgadas com marcadores putativos por citometria de fluxo e a capacidade de auto-renovação das células salgadas é avaliada pelo ensaio de formação de esferas.
O ensaio de formação da colônia é realizado para avaliar a radiosensibilidade das células salgadas. Determina quantas células perderam sua capacidade de gerar a síntese que formam a colônia após uma certa dose de radiação. Este manuscrito fornece os poucos passos iniciais para o estudo de radiosensibilidade das células-tronco do câncer, que estabelece a base para um estudo mais completo do mecanismo.
O estudo do mecanismo pode envolver proteínas relacionadas à reparação de danos no DNA, liberação de espécies reativas de oxigênio, prisão do ciclo celular, etc. Ele fornecerá insights importantes sobre como as células-tronco do câncer recebem radioresistância e como superar a resistência. Demonstrando o procedimento de radiação estará Chen-Nan Li, um técnico de radiação do nosso departamento.
Para iniciar esse procedimento, cultura células A549 em RPMI-1640 médio suplementado com 10% FBS em pratos de 10 centímetros a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, remova o meio de cultura. Lave brevemente as células com três mililitros de PBS.
Em seguida, adicione três mililitros de 0,05% trypsin a cada prato. Remova a trippsina e deixe a trippsina residuária para digerir as células a 37 graus Celsius por um a três minutos. Verifique o descolamento das células com frequência para evitar a digestão excessiva.
Quando as células se soltarem e começarem a se soltar dos pratos, adicione três mililitros de meio RPMI-1640 suplementados com 10% de FBS e transfira a suspensão das células para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 10 mililitros de PBS.
Transfira 0,5 mililitros da suspensão celular para um novo tubo como controle isótipo. Centrifugar tanto o controle quanto os tubos experimentais a 300 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte os supernantes.
Em seguida, diluir tanto o controle do isótipo diconjugado fluorescente quanto o anticorpo na PBS para a concentração ideal titulada para preparar a solução de trabalho. Resuspenque as células de controle e experimentais com cada solução de trabalho e misture suavemente. Incubar as amostras no escuro e à temperatura ambiente por 30 a 40 minutos.
Lave as células adicionando 10 mililitros de PBS, misturando suavemente, e centrifugando a 300 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte os supernantes e resuspenque as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, coloque 40 filtros de células de micrômetros em novos tubos de 50 mililitros, certificando-se de preparar uma configuração separada de tubo e filtro para o controle e células experimentais.
Aplique cada suspensão celular no respectivo coador e colete o fluxo através do fluxo. Centrifugar o fluxo através de 300 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células com 0,2 a 1,0 mililitros de PBS e transfira cada suspensão celular em um tubo separado de cinco mililitros para citometria de fluxo.
Em um armário de segurança biológica, prepare uma placa de seis poços para cada dose de radiação, incluindo o grupo cinza zero. Adicione 1,5 mililitros de 1640 de mídia completas a cada poço. Células colhidas diluídas com 1640 mídia completas a uma densidade celular de 1.000 células por mililitro.
Em seguida, adicione a suspensão celular diluída aos poços e agite as placas horizontalmente para distribuir uniformemente as células nos poços. Registo o volume adicionado em cada grupo de dose. Cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Depois que as células se anexarem à parte inferior dos poços, adicione 1640 de mídia completas a cada poço até que a altura da mídia atinja um centímetro. Quando as placas forem transferidas entre a sala de cultura celular e a sala de radioterapia, enrole as placas com papel alumínio ou coloque-as em uma caixa limpa para evitar contaminação. Segure as placas planas para evitar derramamento médio.
Em seguida, fixado em 20 centímetros por campo de radiação de 20 centímetros. Coloque um bolus equivalente a tecido de 1,0 centímetro de espessura no sofá do tratamento e coloque a placa de seis poços no bolus para mantê-los em contato. Certifique-se de que toda a placa está dentro do campo de radiação.
Ajuste a distância de origem da pele como 100 centímetros e ajuste a altura do sofá de tratamento para alinhar o nível médio da superfície ao nível de laser. Entregue a dose atribuída a cada placa em sequência. Depois disso, leve as placas para o armário de biossegurança na sala de cultura celular.
Substitua o meio em cada poço por dois mililitros de meio 1640 completos. Cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, certificando-se de mudar o meio a cada três ou cinco dias. Sete a dez dias após a radiação, remova o meio e lave brevemente as células com PBS.
Em um capô de fumaça, adicione um mililitro de 4% de formaldeído a cada poço para fixar as células por 10 minutos. Em seguida, remova o formaldeído e lave cada poço duas vezes usando dois mililitros de água destilada para cada lavagem. Adicione um mililitro de 1% Solução de mancha violeta cristalina a cada poço e manche por 10 minutos.
Depois disso, remova a solução de mancha violeta cristalina e lave as células três vezes com água destilada. Retire a água e deixe as placas secarem por 30 minutos. Conte o número de colônias com mais de 50 células.
Neste estudo, ambos alfa dois delta um alto e alfa dois delta um baixo A549 células são classificadas. Alguns marcadores podem mostrar populações distintas e são fáceis de gate. No entanto, alguns marcadores apenas mostram padrões de alta e baixa expressão, em vez de populações positivas e negativas distintas.
Nesta situação, um controle de isótipo é muito importante para o gating. A expressão de alfa dois delta um em células classificadas é validada por qPCR. A expressão de CACNA2D1, o gene que codifica alfa dois delta um, é maior em células alfa duas deltas de alta em comparação com alfa dois delta uma células baixas.
A morfologia típica das esferas e a eficiência da formação da esfera são mostradas aqui. Alfa dois delta uma células altas mostram maior eficiência de formação de esferas, sugerindo uma maior capacidade de auto-renovação. Imagens típicas de colônias e curvas de sobrevivência são mostradas aqui.
Uma colônia com cerca de 50 células pode ser examinada sob um microscópio e marcada como referência. O número de colônias é contado, então uma fração de sobrevivência em cada dose pode ser calculada e uma curva de sobrevivência pode ser plotada. Alfa dois delta uma células altas são relativamente resistentes à radiação em comparação com alfa dois delta uma células baixas.
Quaisquer etapas relacionadas à cultura celular devem ser realizadas no gabinete de segurança biológica ou no banco limpo laminar. Para evitar contaminação, recomenda-se adicionar antibióticos ao meio da cultura após a triagem. Quando um marcador de células-tronco de câncer putativo é identificado preliminarmente pelo ensaio de formação da esfera, uma caracterização adicional pelo ensaio de diluição in vivo limitando pode ser realizada para avaliar a capacidade tumorigênica.
A partir do estudo do mecanismo de radioresistância, os pesquisadores podem examinar a proteína relacionada à reparação de danos no DNA, liberação de espécies reativas de oxigênio e prisão do ciclo celular em resposta à radiação. Durante a radiação celular, observe que o acelerador linear só pode ser operado por técnicos qualificados. Fique longe da radiação.
Enquanto estiver em pé, por favor, note que o formaldeído é volátil e perigoso. Use formaldeído no capô da fumaça.
