Compostos fotocontrolados, biologicamente ativos, contêm fragmentos reversivelmente fotoisorizáveis, fotointerruptores em suas moléculas. Os compostos são peptídeos cíclicos modificados por um fragmento de diarileteno que sofre transformações eletrocíclicas reversíveis induzidas pela luz. Eles podem mudar de foto, ou seja, alternar entre uma forma biologicamente inativa gerada por UV e uma forma biologicamente ativa gerada por luz vermelha.
Acredita-se que as drogas fotocomutáveis são mais seguras do que as não fotocomutáveis. Isso ocorre porque você pode administrar uma forma não tóxica e desativada ao corpo humano e ativá-la localmente com luz apenas onde você precisa, que é, por exemplo, tumores, trados ou feridas. Não existem métodos ou protocolos padrão para o desenvolvimento pré-clínico ou clínico de tais drogas fotofarmacológicas, por isso, aqui, queremos mostrar-lhe experimentos que podem ser usados para esta pesquisa pré-clínica inicial.
Kateryna Horbatok e Tetiana Makhnii demonstrarão os procedimentos. Os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Bioética da Bienta Company. Comece preparando os buffers usando procedimentos padrão.
Alternativamente, use soluções disponíveis comercialmente. Preparar soluções estoque de compostos. Para cada composto, pesar dois lotes de 5,12 miligramas do composto no fotofórmio fechado em anel em dois tubos Eppendorf de 1,5 mililitro, um com paredes claras e outro com paredes pretas não transparentes.
Como controle positivo, pesar 2,28 miligramas do peptídeo pai, não fotocontrolado, em um tubo extra. Adicione 100 microlitros de DMSO puro a cada amostra e o vórtice por 30 segundos. Fotoisomerizar a solução estoque no tubo de parede transparente irradiando a solução com um laser de 650 nanômetros, densidade de potência de luz de 6 watts por centímetro quadrado, com vórtice para garantir a mistura.
Continue até que a cor mude de roxo escuro para marrom claro. Proteja da luz com papel alumínio. Semente 5, 000 a 10, 000 células por poço.
Foram utilizadas cerca de 8.000 células de carcinoma pulmonar de Lewis em 200 microlitros de DMEM nos 60 poços centrais de uma placa estéril de 96 poços com fundo claro e paredes pretas e não transparentes. Preencha os 36 poços restantes com DMEM puro. Incube as placas a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de CO2 durante a noite.
No dia seguinte, preparar diluições seriadas dos compostos e o controle positivo em placas transparentes autoclavadas de polipropileno. Comece com os estoques em DMSO e dilua com DMEM, mas não exceda 1% de volume de DMSO na concentração final mais alta. Para evitar a fotoisomerização descontrolada dos compostos estudados, apague as luzes do gabinete estéril.
Transfira 100 microlitros das diluições para 56 poços com 100 microlitros de DMEM previamente adicionado para atingir a concentração final necessária dos compostos nos poços, tipicamente dentro da faixa de cinco a 150 micromolares. Em seguida, adicione 100 microlitros de DMEM a quatro poços, que servem como controle negativo. Cubra as placas com papel alumínio ou uma tampa plástica não transparente para evitar a troca descontrolada de fotos.
Coloque as placas em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius para o tempo de incubação escolhido. Após as incubações, adicionar 50 microlitros de solução corante por poço às placas. Utilizar cinco micromolares Hoechst 33342 e iodeto de propídio de um micromolar como soluções finais de coloração para este experimento.
Incubar novamente a 37 graus Celsius por 20 minutos. Realize imagens de fluorescência automatizadas usando uma lente objetiva de aumento de 20X. As operações de laboratório para esta parte do método são idênticas às descritas para o experimento 2D: preparação da cultura celular, incubação com os compostos testados e geração de imagens.
No entanto, neste caso, as células são preparadas como esferoides compactos e maduros em uma placa de fundo em U de 384 poços, ultrabaixa adesão, com paredes pretas e não transparentes. O uso de uma placa desse tamanho permite que dois compostos sejam comparados em um experimento. Neste experimento, utilizou-se adicionalmente a calceína AM como terceiro componente da solução corante multicolorida.
As imagens obtidas nos experimentos 2D e 3D são analisadas utilizando-se o software automatizado de análise de imagens dos instrumentos. As células que usam os corantes Hoechst e iodeto de propídio são consideradas necroticamente mortas, e sua fração em função da concentração é usada para calcular o valor de IC50. Montar o trem óptico para a irradiação da amostra.
Consiste em um cabo óptico da fonte de luz laser, uma lente com uma distância focal variável, uma seringa com uma tampa não transparente e uma extremidade de corte plana. Todas as operações subsequentes devem ser realizadas em uma sala escura com iluminação mínima do local de trabalho. Preparar uma amostra de tecido modelo carregada com os compostos fotoformais inativos.
Em uma corrida típica, cinco gramas de carne de porco picada fresca são misturados mecanicamente com a solução PBS do composto para atingir a concentração final de 50 miligramas por quilograma. Encha a seringa com a amostra carregada. Irradiar a amostra no comboio óptico durante a exposição necessária e o tempo de dosagem de luz.
Após a exposição, faça cortes de quatro milímetros de espessura da amostra empurrando a massa para fora da seringa com o pistão e cortando-a com um bisturi. Pesar e extrair o composto com acetonitrila, água, mistura de TFA, 70% acetonitrila e 01% ácido trifluoroacético em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro. Centrifugar a 20XG por 30 minutos duas vezes para remover o material insolúvel e coletar o sobrenadante.
Registre cromatogramas detectados por UV na detecção de 570 nanômetros de sua forma fechada e detecção de 270 nanômetros da forma aberta em anel. Utilizar as amostras de controlo não irradiadas e irradiadas preparadas de forma semelhante às soluções-mãe nas experiências celulares para determinar os tempos de retenção específicos e calibrar o método. Repetir o experimento três vezes e plotar a porcentagem normalizada de cada fotoforma na parcela, porcentagem versus distância da superfície do tecido irradiado.
No dia zero, inocular as fêmeas adultas de 6 camundongos C57 pretos pesando aproximadamente 20 gramas cada por via subcutânea com uma suspensão de cerca de meio milhão de células de carcinoma pulmonar de Lewis em aproximadamente 100 microlitros de DMEM e mistura de Matrigel na pata traseira direita. Esse procedimento é feito sob sedação com isoflurano a 5%. Os animais estão prontos para o tratamento nos dias cinco a oito, quando os tumores são palpáveis.
Todas as operações que envolvam o teste devem ser realizadas em condições semiescuras. Esta condição também se aplica ao tratar os animais após receberem a dose composta por um período de dois dias. Montar aleatoriamente quatro grupos de oito animais, e remover a pele da área do tumor.
Os dois grupos de controle recebem uma injeção intravenosa do veículo. 100 microlitros de solução salina por animal de 20 gramas, e os animais dos dois grupos experimentais receberam o composto testado na fotoforma inativa em solução de um miligrama por mililitro de solução salina. Administrar o bolus composto na veia da cauda a cinco mililitros por quilo.
Duas horas e 45 minutos após a injeção do composto, irradiar a área tumoral por 20 minutos sob anestesia com isoflurano com laser de 650 nanômetros, utilizando densidade de potência luminosa de 100 miliwatts por centímetro quadrado. Observe cuidadosamente as condições dos animais nos próximos 30 minutos. Observe os animais diariamente, e meça seu peso e as dimensões de seus tumores.
Medir os volumes do tumor e observar a progressão da necrose. Determine a taxa de sobrevivência usando o procedimento padrão. Os resultados do nosso protocolo para a primeira etapa no caso de experimentos de cultura de células 2D podem ser apresentados como imagens, como ilustrado aqui em uma imagem representativa para células de carcinoma pulmonar de Lewis incubadas com LMB002 em diferentes concentrações e por diferentes períodos de incubação.
Costaining com Hoechst e iodeto de propídio permite a visualização de núcleos celulares no canal azul, dando assim uma contagem total de células. Células com integridade da membrana plasmática comprometida foram observadas no canal vermelho. Supondo que este último esteja necroticamente morto, a citotoxicidade aparente de um composto em estudo pode ser quantificada como uma porcentagem das células positivas para iodeto de propídio.
Os resultados da quantificação dos dados obtidos por meio da análise automatizada de imagens são apresentados aqui. Para LMB002, dependências sigmoidais da porcentagem de células positivas para iodeto de propídio na concentração do composto podem ser observadas. A partir desses dados, os valores de IC50 podem ser determinados.
Nosso experimento revelou que a forma aberta do LMB002 é cerca de uma etapa de diluição menos tóxica que o peptídeo protótipo, Gramicidin S, enquanto a forma fechada demonstra três a quatro etapas de diluição menor toxicidade, que aumenta com o tempo de incubação. Os experimentos com células 3D produziram o mesmo tipo de dados brutos, as imagens esferoides resolvidas uma por parede. A inclusão da calceína como terceiro corante permite quantificar a fração de células metabolicamente ativas observadas no canal verde.
As curvas de efeito de dose, como as do experimento 2D, foram obtidas a partir das pilhas de imagens Z-stack. O Painel A ilustra tais curvas, corroborando os resultados 2D. Como mostrado no painel B, o diâmetro total do esferoide varia com a concentração do composto.
O experimento para a segunda etapa permite a determinação das concentrações de LMB002 em ambas as fotoformas usando cromatografia líquida de alta eficiência detectada por UV. Ambas as fotoformas foram suficientemente diferentes nos tempos de retenção e absorbância, mostradas integradas nos painéis A e B da figura. Os dados obtidos estão resumidos na figura, confirmando que nossa fonte de luz vermelha induz a fotoconversão LMB002 fechada em anel a uma profundidade de até um centímetro na carne picada a aproximadamente 103 miliwatts por centímetro quadrado.
Os resultados do experimento in vivo, etapa três de nossa metodologia, foram representados por gráficos mostrando o crescimento tumoral em função do tempo nas curvas de sobrevida de Kaplan-Meier. A estratégia aqui representada para avaliar candidatos a fármacos fotocomutáveis é prática e adequada para compostos com fotointerruptores do tipo diarileteno. Na primeira etapa, a quantificação da citotoxicidade pode ser utilizada para a triagem inicial das bibliotecas dos compostos fotocontrolados.
Segundo passo, a avaliação da eficiência do fotoswitching é fácil de configurar e ética. Não requer animais vivos. Etapa três, modelos de fotofarmacologia in vivo, a terapia pode ser aplicada em pequenos animais.
