Neste protocolo de vídeo, demonstramos em detalhes, um sistema cultural para o cultivo de oócitos bovinos. O sistema suporta a viabilidade dos oócitos na cultura por até cinco dias e permite sua diferenciação. Usando este sistema de cultura, os oócitos coletados de pequenos folículos antral, que normalmente não são usados em protocolos padrão para in vitro na produção, podem ser cultivados para aumentar a disponibilidade de gametas fertilizantes.
Essa exploração da reserva mais ampla pode fornecer novas opções para o salvamento genético de espécies ameaçadas, da família bovina, ou de raças locais em risco de erosão genética. Para começar, prepare 15 mililitros de cultura básica e suplemente-o de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, prepare três mililitros de meio de retenção adicionando cinco cilostamida micromolar ao meio de cultura básica e despeje-o em uma placa de Petri de 35 milímetros.
Prepare o meio IVCO longo complementando o meio de cultura básica de acordo com as instruções do manuscrito. Adicione 200 microliters de meio IVCO longo para cada poço de uma placa revestida de 96 poços. Em seguida, encha as quatro bordas com água estéril para compensar a evaporação e manter a umidade adequada durante a cultura.
Incubar a placa de 96 poços e o meio de retenção a 38,5 graus celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade máxima. Lave os ovários quatro vezes em soro fisiológico estéril, mantido a 26 graus celsius. Em seguida, aspire todos os folículos com mais de dois milímetros de diâmetro, com uma agulha de calibre 18 conectada a uma bomba de aspiração.
Renda os ovários aspirados em um béquer com soro fisiológico estéril mantido a 26 graus celsius. Coloque um ovário de cada vez em uma placa de corte PTFE estéril, e use uma lâmina cirúrgica número 22 para cortar fatias de córtex ovariano de 1,5 a 2 milímetros de espessura, e paralelamente ao eixo principal do órgão. Amarre as fatias do córtex ovariano em uma placa de vidro estéril de Petri, com meio dissecando em uma placa quente, a 38,5 graus celsius.
Renda uma fatia de córtex ovariano em uma placa de petri de vidro de 60 milímetros, com dois a três mililitros de M199D sob um microscópio de dissecção, selecione os folículos que estão entre 5 e 2 milímetros. Identifique os folículos não atreóticos saudáveis sob o microscópio estéreo, observando parâmetros morfológicos, como uma aparência translúcida uniformemente brilhante, vascularização extensiva e uma camada regular de granulosa. Enquanto os folículos atreticos têm uma aparência opaca cinza, e são mal vascularizados, com um COC escuro dentro.
Descarte os folículos atreóticos e processe todos os outros. Use a lâmina cirúrgica para remover o tecido ovariano ao redor do folículo de um lado, até que seja exposto. Em seguida, use uma agulha de calibre 26 para fazer cuidadosamente uma fenda na parede do folículo exposto, que liberará o conteúdo folicular que compreende o COC, fluido folicular e aglomerados de células.
Identifique o COC e examine-o para integridade cumulus, integridade zona pellucida e homogeneidade do citoplasma. Se esses critérios forem preenchidos, aspire o COC com uma pipeta P20. Amarre o COC isolado em cilostamida M199D, e continue o procedimento de isolamento por 30 minutos.
Depois de selecionar COCs, como descrito anteriormente, prepare 16 gotas com 20 microlitrais de cilostamida M199D em uma placa de Petri de 60 milímetros, e coloque um COC saudável em cada gota. Use um microscópio invertido ligado a uma câmera para medir o diâmetro do oócito, excluindo a zona pellucida. Com uma visualização clara do oócito, faça duas medições perpendiculares, assegurando que a média das duas medidas está dentro de uma faixa de 100 a 110 micrômetros.
Pode ser difícil medir precisamente o diâmetro dos oócitos, devido às células cumulus companheiras. CoCs que tenham oócitos com diâmetro menor ou maior, ou que não tenham um oócito arredondado, ou aqueles com oócitos que não sejam mensuráveis, devem ser descartados. Transfira os COCs selecionados para um prato de 35 milímetros contendo m199H médio, e mantenha-os na incubadora a 38,5 graus celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade máxima, certifique-se de que o tempo de trabalho geral não exceda duas horas.
Uma vez concluídos os procedimentos de seleção e coleta, transfira um COC para o centro de cada poço da placa de 96 poços previamente preparada. Incubar a placa por cinco dias a 38,5 graus celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade máxima, refrescar o meio a cada dois dias. Para renovar o meio, substitua 100 microlitros de meio antigo por 100 microlitros de meio IVCO longo fresco, faça isso sob o microscópio estéreo para evitar mover os COCs.
No final do longo IVCO, analise a morfologia dos COCs. Se eles tiverem um investimento compacto de células cumulus sem nenhum sinal de expansão cumulus, ou degeneração celular, classifique-os como classe um. Se os COCs tiverem um investimento compacto de células cumulus sem sinal de expansão cumulus ou degeneração celular, e com uma ou mais formações semelhantes a antrum, classifique-os como classe dois.
Classe três COCs, mostram várias camadas de células cumulus sem nenhum sinal de expansão cumulus, algumas células desagregadas na camada externa das células cumulus e nenhuma formação semelhante a antro. Classificar os COCs como classe quatro se eles mostrarem perda abundante de células cumulus estendendo-se por mais de 50% da superfície oócito, bem como sinais de degeneração celular e detritos celulares. No final do longo IVCO a morfologia bruta do COC é alterada.
E quatro classes foram identificadas com base no aparecimento das células cumulus. Ao todo, foram analisados 74 oócitos em cinco réplicas biológicas, das quais 9,45% foram descartadas de uma avaliação posterior. As classes um, dois e três foram julgadas saudáveis, enquanto a classe quatro apresentou sinais claros de degeneração, como a ausência de camadas completas de células cumulus ao redor dos oócitos.
Estes COCs foram considerados inadequados para serem submetidos a procedimentos a jusante em um possível ajuste ivp. A avaliação da etapa meiotic no final do longo IVCO mostrou que um percentual significativamente maior dos oócitos permaneceu preso na fase imatura, com a cromatina ainda fechada dentro do VG. Quando a condensação da cromatina dentro do GV foi investigada como um marcador de ganho de competência, a transição da configuração da cromatina para estágios mais condensados, ou seja, GV dois e GV três, foi observada em 59% dos oócitos. Uma pequena porcentagem retomada da meiose atingindo metafáse um estágio, ou degeneração.
Esses resultados demonstram que a cultura L-IVCO apoia a viabilidade do oócito, evitando a retomada do meiotico por cinco dias. Ao final do longo IVCO, os COCs podem ser usados em procedimentos a jusante da produção de embriões in vitro, ou seja, maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões. Essas etapas são necessárias para comprovar o conceito de que o oócito adquiriu maior competência de desenvolvimento.
Além de ter o potencial de aumentar a quantidade de oócitos fertilizantes, o longo sistema de cultura IVCO é uma ferramenta para cientistas interessados em dissecar os processos celulares e moleculares que regulam a formação de um gamete competente.
