Muitos alérgenos ligam moléculas hidrofóbicas. Este protocolo permite a remoção completa e substituição desses ligantes, permitindo-nos estudar seu impacto na estrutura e na imunogenicidade de forma sistemática. O uso do HPLC de fase inversa, aliado ao ressarcimento térmico, tem duas vantagens.
Ele remove ligantes endógenos, e ajuda a solubilizar ligantes para abrir locais de ligação inacessíveis. Se pudermos determinar os fatores que contribuem para a alergenicidade, podemos ser capazes de projetar terapias que evitem esses fatores. Muitas proteínas ligam ligantes lipídicos, que são fortemente retidos e podem influenciar tanto a estrutura quanto a função.
Nosso método permite o estudo sistemático dessas interações. A solubilidade limitada e a acessibilidade de muitas cargas lipídicas podem inibir o processo de carregamento. Certifique-se de cuidar ao preparar esses ligantes e considerar a necessidade de adaptações específicas do sistema.
Como trabalhar com ligantes hidrofóbicos e insolúveis é um ajuste para alguns alergistas e bioquímicos, pode ser útil ver como as amostras se parecem em diferentes estágios. Após a clonagem da expressão e purificação, aplique 12 mililitros do Bla g 1 cerrado a uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular de menos de 10 quilodalton para múltiplas centrífugas em um rotor de balde de balanço até que o volume total tenha sido reduzido a menos de dois mililitros. Carregue o concentrado resultante em um sistema HPLC de 250 por 10 milímetros equipado com uma coluna de cromatografia de fase reversa C18 equilibrada com 97% tampão A e 3% tampão B.Elute Bla g 1 a uma taxa de fluxo de 1,5 a 4 mililitro por minuto, conforme indicado na tabela, usando a absorvência de fluorescência em 280 nanômetros para monitorar o processo de elução.
A partir de cerca de 34 a 40 minutos e uma concentração de buffer B acima de 74% coletam não mais do que quatro mililitros de cada fração Bla g 1. Aliquot a fração Bla g 1 agrupada em tubos de teste de vidro. Cubra os tubos com filme de parafina e perfure o filme com dois buracos.
Em seguida, congele as amostras a menos 80 graus Celsius por uma hora e use um liofilizador para secar as amostras de proteínas desalíidas resultantes. Para determinar o rendimento de Bla g 1 antecipado, suspenda desagrava uma alíquota de teste desfiliada liofilizada em cinco mililitros de tampão de repato. Aqueça a mistura em um béquer de 500 mililitros contendo 250 mililitros de água a 95 graus Celsius em uma placa quente com vórtice de agitação e intermitente.
Segure a solução em 95 graus por 30 a 60 minutos antes de permitir que o banho de água se equilibre lentamente à temperatura ambiente. Quando a solução tiver esfriado, passe a mistura lipídica Bla g 1 edaled através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons para remover material particulado, e use um novo filtro centrífuga com um corte de 10 kilodalton para tampão trocar a proteína filtrada três vezes em PBS para remover quaisquer ácidos graxos livres residuais e solvente orgânico. Em seguida, avalie a concentração proteica utilizando um ensaio padrão de análise de proteínas para determinar o rendimento previsto para as alíquotas restantes de Bla g 1.
Para reconstituir o Apo-Bla g 1, suspenda novamente as alíquotas Bla g 1 em cinco mililitros de tampão de repato por alíquota, e recotre as amostras conforme demonstrado. Para carregar o Bla g 1 com fosfolipídios, adicione 10 miligramas da carga desejada a um tubo de teste de vidro e dissolva-se em clorofórmio, e evaporar o clorofórmio para produzir um filme lipídedo. Em seguida, adicione PBS ao tubo para produzir uma concentração fosfolipítida final de 20 milimiliar.
Aqueça o fosfolipídio acima da temperatura de transição de fase da carga lipídica para reidratar o filme lipíduo e o vórtice até que a solução fique nublada. Em seguida, adicione a carga lipídica fosfo para produzir um excesso molar de 20X de ligantes em relação a Bla g 1 com base no rendimento previsto. Um precipitante pode se formar.
Vórtice para misturar antes de ressarar a proteína como demonstrado. Para confirmar a remoção ou carregamento de carga por fósforo-31 NMR, use um filtro centrífuga para concentrar a amostra a mais de 100 micromolars, como demonstrado. Prepare amostras fosfolipíides de referência de concentrações conhecidas no buffer PBS como indicado, e dilua a referência final bla g 1 a uma razão de 1:1 com tampão de colado para um volume total de cerca de 600 microliters.
Use uma sonda de banda larga para adquirir espectros NMR de 31-fósforos unidimensionais do coládido solubilizado Bla g 1 e padrões fosfolipídid de referência, e compare o espectro de NMR fosforoso bla g 1 31 com os obtidos para amostras de referência fosfolipípica para confirmar a remoção de ligantes endógenos e/ou a ligação dos ligantes desejados com base nas mudanças químicas dos picos visíveis, em seguida, compare a intensidade máxima do espectro Bla g 1 com a dos padrões de referência fosfolipídid para permitir a confirmação da estequiometria de ligação completa. Usando cromatografia de afinidade, o GST Bla g 1 recombinante pode ser prontamente isolado a um alto nível de pureza, produzindo um rendimento de dois a quatro miligramas por litro de cultura celular. A incubação noturna com protease TEV a quatro graus Celsius é suficiente para remover a tag GST, produzindo o produto final em aproximadamente 24 kilodaltons.
A aplicação do Bla g 1 a uma coluna C18 de fase inversa produz um perfil de elução distinto, com dois picos grandes a 50% de buffer B, e um segundo grande pico em 75% tampão B.Phosphorus-31 NMR espectros de Apo-Bla g 1 não mostram fósforos detectáveis. Uma curva padrão pode ser produzida a partir do NMR usando amostras de referência de concentrações de DSPC conhecidas. Comparando a intensidade do sinal fosforoso 31 obtida do DSPC Bla g 1 com esta curva padrão pode ser usado para produzir a estequiometria de ligação dos lipídios por proteína.
Espectros de dicroma circular para Apo-e lipídios carregados Bla g 1 mostram minima de 220 e 210 nanômetros, indicativo de uma estrutura predominantemente alfa-helicoidal. Ensaios de desnaturação térmica baseados em dicromaísmo circular também mostram uma perda cooperativa de estrutura secundária alfa-helicana, indicativo de um domínio globular dobrado. Além disso, a análise das temperaturas de fusão resultantes revela um aumento significativo sobre a ligação de ligantes nMix, consistente com Bla g 1 obtido de sua fonte de alergênico natural.
O sucesso deste protocolo baseia-se na capacidade de superar tanto a solubilidade limitada dos ligantes hidrofóbicos, quanto a natureza inacessível da cavidade de ligação Bla g 1. Este procedimento estabelece as bases para estudos imunológicos, como ensaios de proliferação de células T, para avaliar o efeito dos ligantes lipídicos na sensibilização e os mecanismos moleculares pelos quais isso ocorre. Acoplando este procedimento com outros ensaios biofísicos, mostramos que a ligação de ligantes hidrofóbicos aumenta a estabilidade de Bla g 1, com potenciais implicações a jusante para geração de epítope e alergenicidade.
