O vírus herpes simplex oncolítico é uma forma emergente de imunoterapia contra o câncer. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação titeric do vírus é fundamental para o uso em estudos experimentais. Este método é muito simples e pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de nível dois de biossegurança para receber um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.
A produção de um estoque viral puro e de alta qualidade é crucial, uma vez que é usada para estudar a resposta imune anticancerígena e desenvolver uma nova forma de imunoterapia contra o câncer baseada em vírus. Este protocolo pode ser usado para purificar qualquer vírus herpes simplex de tipo selvagem ou geneticamente modificado. Este protocolo deve ser fácil de ler e fácil de seguir para um indivíduo que nunca realizou essa técnica antes.
Os materiais listados e reagentes devem estar no lugar antes de experimentar esta técnica pela primeira vez. Comece lavando os frascos de centímetros quadrados T-150 com duas vezes alta glicose DPBS suplementada com 1%IFCS. Aspire o DPBS e adicione sete mililitros de inóculo de vírus por frasco.
Balance suavemente os frascos por cinco minutos e incubar a 37 graus Celsius por 1,5 a 2 horas. Em seguida, remova o inóculo e adicione 25 mililitros de DMEM suplementados com 1%IFCS a cada frasco. Após a incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias, colete 20 mililitros da cultura sobrenasal de cada frasco em tubos de centrífuga de 50 mililitros.
Usando um raspador de células, raspe as células do fundo dos frascos. Adicione aproximadamente 15 mililitros da cultura anteriormente coletada sobrenatante a cada frasco para trazer o volume até 20 mililitros, em seguida, use uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros para lavar suavemente o fundo dos frascos algumas vezes. Colete as células com médio em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros colocados no gelo.
Centrifugar os tubos a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda cada pelota completamente em 1,25 mililitros de tampão de vírus, ou VB, e 1,25 mililitros de supernanato de cultura previamente coletado. Misture todas as pelotas resuspended em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros.
Esperte as células resuspended usando gelo seco e 100% etanol e armazene a menos 80 graus Celsius. Descongele as células congeladas anteriormente quebradas em um banho de água quente a 37 graus Celsius e sonicate por um minuto por três ciclos em um banho de água. Adicione 175 unidades de Benzonase Nuclease e dois microliters de dois cloreto de magnésio mililitro por mililitro da célula lysate e vórtice.
Depois de uma incubação de 30 minutos e banho de água morna a 37 graus Celsius, coloque o tubo no gelo. Gire a célula lysate a 300 vezes G por 10 minutos. Colete o supernatante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros e resuspense a pelota celular em 500 microliters de VB. Designe-o como uma pelota.
Gire o supernasal coletado novamente a 500 vezes G por 10 minutos e armazene o supernasal separadamente em um tubo de centrífuga cônica fresco de 50 mililitros para usar mais tarde. Resuspend a pelota de célula em 500 microliters de VB, designando-a como pelota dois. Combine a pelota resuspended um e pelota dois em um novo tubo de centrífugo de 1,75 mililitro e vórtice e sonicato duas vezes em um banho de água antes de girar os tubos a 400 vezes G por 10 minutos.
Colete o supernasal de tubo de centrífuga de 1,7 mililitro e combine-o com o supernasal previamente coletado tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Filtre o supernatante através de um filtro de membrana PVDF de cinco micrômetros estéreis em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros chamado tubo um. Adicione um mililitro de VB ao tubo de centrífuga de 50 mililitros, esvaziado após filtrar o supernatante da etapa anterior, vórtice, e passá-lo através do mesmo filtro de membrana PVDF colocado no tubo um.
Passe o filtrado do tubo um através de um filtro de membrana MCE de 0,8 micrômetros estéril colocado em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros chamado tubo dois. Adicione um mililitro de VB ao tubo esvaziado, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro MCE colocado no tubo dois. Passe o filtrado do tubo dois através de um filtro PVDF de 0,45 micrômetros estéril colocado em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros rotulado tubo três.
Como descrito anteriormente, repita a lavagem do tubo dois com um mililitro de VB para adicionar filtrado ao tubo três. Nesta análise representativa, o efeito citopático pôde ser observado nas células Vero aos 36, 48 e 72 horas após a infecção por OHSV com o arredondamento das células afetadas. O nível crescente de CPE ao longo do tempo é evidente como visualizado pela expressão mCherry.
Às 72 horas após a infecção, placas virais foram manchadas com X-gal para visualizar oHSVs com expressão lacZ. Esfregar suavemente as células infectadas pelo vírus e lavar suavemente a parte inferior do frasco é fundamental para manter intactas todas as células infectadas pelo HSV para que um alto estoque viral de titer possa ser obtido.
