종양용용성 포진 심플렉스 바이러스는 암 면역 요법의 출현 형태입니다. 바이러스 전파, 정화 및 적정 결정의 효율적인 시스템은 실험 연구에서 사용에 매우 중요합니다. 이 방법은 매우 간단하며 모든 생체 안전 수준 2 실험실 설정에서 쉽게 채택되어 전임상 연구를 위한 고품질 바이러스 재고를 받을 수 있습니다.
높은 품질의 순수 바이러스 재고의 생산은 항암 면역 반응을 연구하고 바이러스 기반 암 면역 요법의 새로운 형태를 개발하는 데 사용되기 때문에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 또는 유전자 조작 된 포진 심플렉스 바이러스를 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 읽기 쉽고 이전에이 기술을 수행 한 적이없는 개인을 위해 따라하기 쉬워야합니다.
나열된 재료와 시약은 이 기술을 처음으로 시도하기 전에 제자리에 있어야 합니다. T-150 평방 센티미터 플라스크를 2 배 높은 포도당 DPBS로 세척하여 1 %IFCS로 보충합니다. DPBS를 흡인하고 플라스크 당 바이러스 접종7 밀리리터를 추가합니다.
플라스크를 5분간 부드럽게 흔들고 섭씨 37도에서 1.5~2시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 접종을 제거하고 각 플라스크에 1 %IFCS로 보충 DMEM의 25 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2~4일 동안 배양한 후, 각 플라스크에서 50밀리리터 원심분리기 튜브로 20밀리리터의 배양 슈퍼리터를 수집합니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 셀을 긁어냅니다. 이전에 수집된 배양 상수의 약 15밀리리터를 각 플라스크에 첨가하여 최대 20밀리리터의 부피를 가져온 다음 10밀리리터 멸균 서로지학적 파이펫을 사용하여 플라스크 바닥을 몇 번 부드럽게 세척합니다. 얼음 위에 놓인 50밀리리터 원심분리기 튜브로 배지를 가진 세포를 수집합니다.
4°C에서 10분 동안 300배 G로 튜브를 원심분리합니다. 각 펠릿을 바이러스 완충제 또는 VB, 및 이전에 수집한 배양 상수의 1.25 밀리리터에서 철저히 재보종. 모든 재중단 된 펠릿을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 섞습니다.
드라이 아이스와 100% 에탄올을 사용하여 재중단 된 세포를 얼리고 영하 80도에 보관하십시오. 이전에 스냅된 냉동 세포를 따뜻한 수조에서 섭씨 37도에서 해동하고 수조에서 3주기 동안 1분간 초음파 처리합니다. 벤조나제 뉴클레아제 175단위와 세포 용해및 소용돌이의 밀리리터당 염화 마그네슘 2개소2개소를 첨가한다.
30분의 배양과 섭씨 37도의 따뜻한 수조후, 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 셀 용해를 300회 G에서 10분간 회전시합니다. 새로운 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에서 상퍼를 수집하고 VB의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 펠릿 하나로 지정합니다.
수집된 상체를 500회 G에서 10분 동안 다시 회전시키고, 상체를 신선한 50밀리리터 원심분리기 튜브에 따로 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다. VB의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하여 펠릿 2로 지정합니다. 재중단 된 펠릿 1개와 펠릿 2개를 새로운 1.75 밀리리터 원심분리기 튜브와 소용돌이에 결합하고 수조에서 두 번 초음파 처리한 후 튜브를 400회 G로 10분 간 회전시보세요.
1.7 밀리리터 원심분리기 튜브에서 상퍼를 수집하고 이전에 수집된 50밀리리터 원심분리기 튜브와 결합합니다. 멸균 5 마이크로미터 PVDF 멤브레인 필터를 통해 상체를 튜브라고 하는 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 VB 1밀리리터를 넣고, 이전 단계에서 상퍼를 걸러낸 후 비워져 튜브에 배치된 동일한 PVDF 멤브레인 필터를 통과한다.
튜브 2라고 불리는 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 배치된 멸균 0.8 마이크로미터 MCE 멤브레인 필터를 통해 튜브 하나에서 여과물을 전달합니다. 비운 튜브 1개, 소용돌이에 VB 1밀리리터를 넣고 튜브 2에 배치된 동일한 MCE 필터를 통과합니다. 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브 3에 배치멸균 0.45 마이크로미터 PVDF 필터를 통해 튜브 2에서 여과를 전달합니다.
앞에서 설명한 바와 같이, 튜브 3에 여과를 추가하기 위해 VB의 1 밀리리터로 튜브 2의 세척을 반복합니다. 이러한 대표적인 분석에서, 세포요법 효과는 영향받은 세포의 반올림을 통해 oHSV 감염 후 36, 48 및 72시간 후 베로 세포에서 관찰될 수 있었다. 시간이 지남에 따라 CPE의 증가 수준은 mCherry 표현에 의해 시각화로 분명하다.
감염 후 72시간 동안, 바이러스 플라크는 X-gal으로 염색되어 lacZ 발현으로 oHSV를 시각화했습니다. 바이러스 감염 세포를 부드럽게 스크러빙하고 플라스크에 바닥을 부드럽게 세척하는 것은 모든 HSV 감염된 세포를 그대로 유지하는 것이 매우 중요합니다.
