Onkolitik herpes simpleks virüsü kanser immünoterapisinin acil bir şeklidir. Etkili bir virüs yayılma, arınma ve titerik belirleme sistemi deneysel çalışmalarda kullanım için kritik öneme sahiptir. Bu yöntem çok basittir ve klinik öncesi çalışmalar için yüksek kaliteli bir viral stok almak için herhangi bir biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvar ortamında kolayca benimsenebilir.
Yüksek kaliteli, saf viral stok üretimi, antikanser immün yanıtı incelemek ve virüs bazlı kanser immünoterapisinin yeni bir formunu geliştirmek için kullanıldığından çok önemlidir. Bu protokol herhangi bir vahşi tip veya genetik olarak tasarlanmış herpes simpleks virüsünü arındırmak için kullanılabilir. Bu protokolün okunması kolay ve daha önce bu tekniği hiç yapmamış bir birey için takip edilmesi kolay olmalıdır.
Listelenen malzemeler ve reaktifler bu tekniği ilk kez denemeden önce yerinde olmalıdır. T-150 santimetrekare şişelerini iki kat yüksek glikoz DPBS ile yıkayarak başlayın% 1 IFCS ile desteklenmiştir. DPBS'yi aspire edin ve şişe başına yedi mililitre virüs inoculum ekleyin.
Şişeleri beş dakika hafifçe sallayın ve 37 santigrat derecede 1,5 ila 2 saat kuluçkaya yatırın. Ardından, inoculumu çıkarın ve her şişeye%1 IFCS ile desteklenmiş 25 mililitre DMEM ekleyin. 37 santigrat derecede inkübasyon ve iki ila dört gün boyunca% 5 karbondioksitten sonra, her şişeden 20 mililitre kültür süpernatantını 50 mililitre santrifüj tüplerine toplayın.
Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri şişelerin altından kazıyın. Hacmi 20 mililitreye çıkarmak için her şişeye daha önce toplanan kültür süpernatantından yaklaşık 15 mililitre ekleyin, ardından şişelerin altını birkaç kez hafifçe yıkamak için 10 mililitre steril serolojik pipet kullanın. Hücreleri orta ile buza yerleştirilmiş 50 mililitre konik santrifüj tüpleri halinde toplayın.
Tüpleri 300 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Her peletin 1,25 mililitre virüs arabelleği veya VB ve daha önce toplanmış kültür üstnatantının 1,25 mililitresinde iyice yeniden biriktirin. Tüm resüspended peletleri bir 50 mililitre konik santrifüj tüpüne karıştırın.
Snap, yeniden depolanan hücreleri kuru buz ve % 100 etanol kullanarak dondurun ve eksi 80 santigrat derecede depolayın. Daha önce kırılan donmuş hücreleri 37 santigrat derecede ılık bir su banyosunda çözün ve bir su banyosunda üç döngü için bir dakika sonicate yapın. Hücre lisat ve girdabının mililitresi başına 175 birim Benzonase Nükleaz ve iki milimoler magnezyum klorür mikrolitresi ekleyin.
30 dakikalık bir kuluçkadan ve 37 santigrat derecede ılık su banyosundan sonra, tüpü buza yerleştirin. Hücre lisatını 10 dakika boyunca 300 kez G'de döndürün. Süpernatantı yeni bir 50 mililitre konik santrifüj tüpünde toplayın ve hücre peletini 500 mikrolitre VB'de yeniden biriktirin. Pelet bir olarak belirle.
Toplanan süpernatantı 10 dakika boyunca 500 kez G'de tekrar döndürün ve süpernatantı daha sonra kullanmak üzere taze 50 mililitre konik santrifüj tüpünde ayrı ayrı saklayın. Hücre peletini 500 mikrolitre VB'de yeniden dirildirerek pelet iki olarak belirledi. Tüpleri 10 dakika boyunca 400 kez G'de döndürmeden önce, yeniden su banyosunda yeniden 400 kez pelet bir ve pelet iki yeni bir 1.75 mililitre santrifüj tüp ve girdap ve sonicate birleştirin.
Süpernatantı 1,7 mililitre santrifüj tüpünden toplayın ve daha önce toplanan 50 mililitre konik santrifüj tüpü ile birleştirin. Süpernatantı steril beş mikrometre PVDF membran filtresinden tüp bir adı verilen yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpüne filtreleyin. 50 mililitrelik santrifüj tüpüne bir mililitre VB ekleyin, süpernatantı önceki adım olan girdaptan süzdükten sonra boşaltın ve birinci tüpe yerleştirilen aynı PVDF membran filtresinden geçirin.
Filtratı tüp 1'den tüp iki adı verilen yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpüne yerleştirilen steril 0,8 mikrometre MCE membran filtresinden geçirin. Boşaltılan tüpe bir mililitre VB ekleyin, girdap ve tüp ikiye yerleştirilen aynı MCE filtresinden geçirin. Filtratı tüp ikiden, tüp üç etiketli yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpüne yerleştirilmiş steril 0,45 mikrometre PVDF filtreden geçirin.
Daha önce açıklandığı gibi, tüp üçe filtrat eklemek için tüp ikinin bir mililitre VB ile yıkanmasını tekrarlayın. Bu temsili analizde, etkilenen hücrelerin yuvarlanması ile oHSV enfeksiyonu sonrası 36, 48 ve 72 saat sonra Vero hücrelerinde sitopatik etki gözlenebilir. Zaman içinde artan CPE seviyesi, mCherry ifadesiyle görselleştirildiği gibi belirgindir.
Enfeksiyon sonrası 72 saat sonra, viral plaklar lacZ ekspresyonu ile oHSV'leri görselleştirmek için X-gal ile boyandı. Virüs bulaşmış hücreleri hafifçe ovalamak ve şişenin tabanını hafifçe yıkamak, tüm HSV enfekte hücreyi sağlam tutmak için kritik öneme sahiptir, böylece yüksek titre viral stok elde edilebilir.
