Trabalho no laboratório é financiado pelo Hammarlund: NIH concede NS066082 R01-01 e T32GM007223, a Fundação Beckman, eo Ellison Medical Foundation.

1. Montagem do sistema Os componentes específicos do nosso sistema são descritos abaixo. Quando devidamente instalados, o usuário deve ser capaz de se concentrar no microscópio com uma mão, mover o palco com o outro (seja com o mouse ou o joystick), ativar o laser com o pedal, e tem uma visão clara do on- imagem na tela. <ol><li> Micropoint laser montado à porta de epi-fluorescência de um microscópio composto. Nós usamos uma Nikon 80i, mas qualquer escopo de pesquisa grau vertical ou invertida deve funcionar. O sistema irá incluir um Micropoint dichroic personalizado, que deve corresponder ao que os rótulos fluoróforo as células que você deseja cortar. Células marcadas com fluoróforos corte alternativa requer dichroics adicionais. Além disso, um gerador de pulso e pedal vêm com o sistema Micropoint. </li><li> 100x, 1,4 objetivo de petróleo NA para realizar a cirurgia e avaliação de regeneração, além de objetivos adicionais, conforme necessário para colocar a amostra no slide. Usamos um Plano Nikon Apo VC para a cirurgia, e descobrir que um 4x é útil para focar grossa e encontrando a amostra. </li><li> Motorizada palco com joystick. Um palco com uma precisão extremamente elevada e repetibilidade é desnecessária, uma vez que o palco é utilizado para segmentação. Nós usamos um Prior OptiScan II (ver discussão). </li><li> Câmera. A câmera precisa oferecer uma taxa de quadros suficientes para se concentrar e direcionar a neurite rotulados com o objetivo de 100x, enquanto visualiza a imagem no monitor do computador. Nós preferimos atenuando a luz de iluminação durante o processo de axotomia para evitar potenciais efeitos de confusão de foto-branqueamento ou danos (ver 1.7, abaixo). Assim, a câmera precisa ser sensível o suficiente para acomodar este nível de luz reduzida. Nós usamos um Hamamatsu Orca 05G, e descobrir que imagem em 16,3 Hz é suficiente. Câmeras equivalentes poderiam ser substituídos. </li><li> Computador, monitor, software e imagem que podem levar a câmera. Além disso, usamos o software de imagem para manipular o estágio motorizado com um mouse (ver discussão). </li><li> Mesa de ar. Esta exigência pode variar dependendo da localização, mas desde que a cirurgia é realizada com um objetivo 100x, encontramos o isolamento de vibração a ser essencial. </li><li> Fornecimento de iluminação com guia de luz e um mecanismo de disparo para iluminar o fluoróforo. A guia de luz vai anexar ao Micropoint. O mecanismo de obturador é útil para reduzir a intensidade de iluminação, independentemente do laser. Nós usamos uma Lumen Prior 200 ou uma Leica EL6000, e atenuar até 80% de intensidade de luz total para axotomia. </li></ol> 2. Configuração Laser Um protocolo detalhado para inicialmente harmonizar e concentrar o laser é fornecido com o sistema de laser Micropoint. Nós assumimos que esse processo foi seguido com sucesso na configuração inicial. Isto inclui o alinhamento do laser com a mira na ocular. Aqui nós fornecemos um protocolo para manutenção regular do foco do laser e intensidade. Como observado no manual Micropoint, o laser pulsado de nitrogênio é capaz de prejudicar gravemente o olho humano. Cuidados devem ser tomados para não olhar diretamente para o feixe de laser. Uma vez instalado, o filtro de barreira deve bloquear a radiação de forma segura através da ocular. Corte de neurônios em um organismo do tamanho de um grão de areia pode ser um desafio. Como a área de danos causados ​​pelo laser é muito pequena, é essencial saber a localização tridimensional de foco do laser a fim de orientar a amostra com precisão. O foco do laser é encontrado usando a lâmina espelhada. Primeiro, vamos verificar que o local z do foco do laser corresponde ao foco do caminho de imagem. Em seguida, a localização do foco xy danos são marcados com uma mira no software de imagem. Centrando-se em plano z <ol><li> Empurre o filtro de densidade neutra ND16 (Figura 1a). Usamos filtros de densidade neutra no caminho de epi-iluminação para atenuar o laser enquanto se concentra. Até mesmo para melhor focalização, empurre tanto no ND16 e ND4 filtros fluorescentes. </li><li> Definir o laser Micropoint a 1 pulso com o interruptor virou-se para &#39;Select&#39; (Figura 1b), e depois mover a roda de filtros para o apropriado longa-pass barreira filtro (Figura 1c). </li><li> Coloque o slide espelhado no palco e se concentrar em pinholes dentro dela, com o objetivo 4X usando luz transmitida. </li><li> Adicionar uma gota de óleo de imersão para o slide espelhado e se focar no pinholes com o objetivo 100X. Abrir o obturador da câmera com a alavanca de comutação do caminho óptico (Figura 1d) eo obturador laser (Figura 1e). Se necessário, reduza a intensidade da luz transmitida para que as bordas dos furos são nítidas: isso vai ajudar a focar exatamente. </li><li> Pressione o pedal. Isso deve produzir um pequeno buraco no espelho se o laser é focalizada de forma adequada. </li><li> O foco do microscópio ligeiramente acima do plano da lâmina espelhada e disparar o laser de novo. Isto deve fazer uma ainda menorburaco do que o primeiro tiro, ou não deixam marcas em tudo. Repetir, concentrando-se abaixo da lâmina espelhada. </li><li> Se um buraco não é produzido em 2.5, ou se um buraco maior é produzido quando o foco acima ou abaixo da superfície do espelho, recentrar a laser com o anel de foco na cabeça de ablação. Verifique se o buraco ainda está alinhado com a mira na ocular. Com uso consistente, o foco z-plano raramente precisa de ser ajustada. </li></ol> Centrando-se no plano xy <ol start="8"><li> Siga os passos 2.1 a 2.3 acima e pressione o pedal para fazer um pequeno buraco no slide espelho. </li><li> Iniciar &#39;Live&#39; modo de captura de &#39;adquirir&#39; Elementos menu. Na &quot;medida&quot; da barra de ferramentas selecione &quot;ROI editor &#39;, em seguida, selecione a ferramenta&quot; cruz dupla &quot;e arraste a mira para alinhá-los com o centro do buraco de novo. Clique em &quot;Salvar ROI&quot; e depois &quot;Sair do editor&quot; e retomar o modo de captura Live. </li><li> Ativar a configuração &#39;mouse XY &quot;em Elements para manipular o palco com o mouse. </li><li> Puxe o filtro de densidade neutra (s) de volta à posição original (s), definir a pulsos de laser a 10, e remover o slide espelhado. </li></ol> Ajustar a potência do laser <ol start="12"><li> A potência do laser deve ser ajustado para a potência mínima necessária para cortar o neurônio de sua escolha. Ajustar a potência movendo a placa atenuador (Figura 1f), enquanto o corte vermes vivos (descritas abaixo). Se a potência do laser é muito alta, ele irá causar danos periférica ou explosão de um buraco no worm. Se a potência do laser é muito baixo, não vai cortar o neurônio. Uma vez que o sistema foi criado, a posição do atenuador raramente precisa ser alterado. Se o laser torna-se fraca, ea placa atenuador precisa ser movido para continuar a corte, que poderia ser um sinal de que o corante na célula tintura precisa ser substituído (ver discussão). </li></ol> 3. Imobilizar os vermes <ol><li> Prepare uma solução de 3% agarose fundida em M9 (KH2PO4 22mm, 42mm Na2HPO4, NaCl 85mm, 1mM MgSO4). Dispense 5 mL de agarose fundida em um tubo falcon 15 mL. Preencha outro tubo com água. Colocar os tubos em um elemento de aquecimento modular definido para 55 ° C. Preencha o elemento de aquecimento com água para criar mini-banhos de água para cada tubo. Nota: agarose podem ser preparados em grandes quantidades com antecedência e re-derretido para experimentos subseqüentes. </li><li> Coloque duas camadas de fita de rotulagem em cada uma das duas lâminas e uma lâmina limpa entre os slides. Dispensar uma gota de agarose utilizando uma pipeta lâmpada plástico para o meio da lâmina limpa e coloque outro perpendicular ao primeiro deslize para que o resultado agarose pad é a espessura de dois pedaços de fita adesiva (Figura 2). Remover uma das duas lâminas do bloco após 30 segundos. Lavar e guardar a pipeta no tubo falcon cheio de água para uso com slides subseqüentes. </li><li> Lugar, próximos 3-5 mL de 0,10 m ou 0,05 mM esferas de poliestireno no centro da almofada. Adicionar worms 10/05 expressando a proteína fluorescente nos neurônios de interesse. Se os neurônios de interesse são assimetricamente distribuídos no lado direito ou esquerdo do worm, use uma pick platina para virar worms, para que o lado correto é voltada para cima. Worms devem ser colocadas em lâminas dentro de 10 minutos de preparar as pastilhas de agarose. </li><li> Cuidadosamente coloque uma lamínula sobre os vermes. Depois de colocar a lamínula, não movê-lo em relação ao bloco de agarose como isso irá atrapalhar a cutícula e destruir os vermes. Coloque o slide preparado no palco microscópio. </li></ol> 4. Neurônios corte <ol><li> Luz direta para as oculares com a alavanca do percurso óptico de comutação. Focus on the worm para ser cortado com o objetivo de 4X, coloque uma gota de óleo sobre a lamínula, e mudar para o objetivo 100X. Retornar o caminho óptico para a câmera. </li><li> Use o mouse para mover o neurônio de sua escolha sob o centro da mira. Pressione o pedal para disparar o laser e cortar o processo neuronal. Se necessário, dois conjuntos de impulsos pode ser usada para cortar o neurônio. Em primeiro lugar, é útil para monitorar precisamente o que os neurônios foram cortados em vermes individuais, a fim de avaliar a regeneração subseqüente. Quando realizada corretamente, laser axotomia produz uma pequena pausa no neurônio sem causar danos significativos ao tecido circunvizinho da pele ou outros neurônios (ver Figura 3). Em certos casos, uma pequena cicatriz pode formar em torno do local da lesão. </li><li> Recuperação de vermes, removendo a lamínula em um movimento direto para cima, tomando cuidado para que os vermes continuam no bloco de agarose. Não faça deslizar a lamela off. Em seguida, corte a almofada em torno do worms com agulha nariz forceps e coloque na seção de agarose em um recém-placa NGM semeado contendo OP50 8. Lugar de 10 L de estéril M9 no teclado para libertar os worms de e remover os grânulos agarose. </li></ol> 5. Neurônios pontuação para a regeneração <ol><li> Prepare pad agarose, conforme descrito no passo 2.2. </li><li> Worms lugar em 05/03 emu; L de esferas de poliestireno. Cobrir com uma lamela. Slides pode ser preparado em seqüência, ou, alternativamente, todos os vermes podem ser preparadas com antecedência e os slides mantidos em 10 pratos centímetros cultura, cada uma contendo uma Kimwipe úmido para manter a umidade do agarose. </li><li> Use o objetivo 100X para visualizar os neurônios cortada. Em muitos neurônios, um toco neuronal distal ao local do corte permanecem. Usamos a presença deste remanescente como uma indicação de que o neurônio era realmente cortada (Figura 4). A presença deste coto torna possível distinguir um neurônio que foi cortado e regenerado de uma que não foi cortado. Nota: ambos os cotos distal e proximal inicialmente retrair após ser cortado. </li><li> Avaliar a regeneração. Uma variedade de parâmetros podem ser determinados. Um ensaio simples é se o neurônio feridos formou um cone de crescimento (Figura 4a) e regenerado, ou não (Figura 4b). Alternativamente, o comprimento neurite pode ser rastreada e comparados. </li></ol> 6. Resultados representativos Como exemplo, descrevemos a caracterização de regeneração do ácido γ-aminobutírico (GABA) neurônios motores. Esses neurônios, que residem no cordão nervoso ventral e estender os processos circunferencialmente ao cordão nervoso dorsal, são essenciais para a locomoção adequada 9. Neurônios GABA pode ser visualizado por expressar um fluoróforo geneticamente codificado, como a proteína verde fluorescente (GFP), sob o controle do -47 -25 unc unc ou promotores (cepas EG1285 e CZ1200, respectivamente, disponíveis a partir do C. elegans Centro de Genética ). L4 montagem do palco worms como descrito, flip os vermes para os neurônios GABA em seus lados direito são voltadas para cima, e coloque a lamínula. Corte 03/01 das comissuras posterior em cada minhoca no meio do caminho, entre as cordas dorsal e ventral. Evitar o corte comissuras que cruzam ou fasciculadas com comissuras outros, como estes são difíceis de marcar mais tarde. Recuperar worms como descrito. 18 a 24 horas após uma axotomia bem sucedida, os vermes terá recuperado de uma cirurgia e exibem locomotora normal e egg-laying comportamentos. Descartar vermes que estão mortos ou doentes. Remontar o restante como descrito, e avaliar a regeneração. Nós geralmente visam avaliar pelo menos 30 neurônios corte por condição experimental. Em oxIs12 animais, normalmente 60-70% dos neurônios GABA cortada L4 terá iniciado uma estrutura de cone de crescimento, evidenciado por uma ampliação da membrana na ponta ea extensão de ramos diversos neurite, e migraram a partir do site de corte (Figura 4a). Em muitos casos, os cones de crescimento terão migrado para se reconectar com o cordão nervoso dorsal, uma comissura adjacentes neuronal, ou o coto distal. Os restantes 30% dos neurônios terá quer iniciado há crescimento, formando um coto proximal ao local da axotomia, ou terá prorrogado uma única filopodia pequena (Figura 4b). <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. O UV pulsada a laser do sistema axotomia. Componentes específicos são: (a) filtros ND (b) pulso seletor (c) da alavanca roda de filtros (d) caminho óptico de comutação alavanca (e) do obturador laser e (f) placa atenuador. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Preparação de um bloco de agarose. Para preparar uma almofada de agarose a espessura desejada, duas camadas de fita (verde) são colocados em duas lâminas. Um slide é colocado entre os dois primeiros, e uma gota de agarose é então adicionado ao slide limpo. Finalmente, um quarto slide é colocado perpendicularmente aos primeiros três, resultando em um bloco que é a espessura de dois pedaços de fita adesiva. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representante GABA axotomies neurônio. Em um experimento típico, comissuras GABA neurônio são cortados ao meio da face lateral do worm. A comissura cortada é mostrado imediatamente antes (painel esquerdo) e depois (painel direito) axotomia. Todas as imagens foram tiradas com uma objectiva de petróleo 100X. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Resultados representativos de axotomies GABA neurônio. 24 horas pós-axotomia axônios cortados são marcados para regeneração. Um axônio em regeneração com um cone de crescimento (seta) é mostrado em (a), enquanto um não-regeneração do axônio é visto como um coto proximal (seta) em (b). O coto distal de cada axônio corte é mostrado em cada painel (seta) e é uma indicação de que o axônio tem sido cortada.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma variedade de sistemas laser têm sido usados ​​para cortar neurites em C. elegans, e vários estudos têm examinado o seu desempenho em detalhe 3,7,10,11. O laser Micropoint utilizada em nosso protocolo é um sistema de turnkey que é fácil de configurar e manter, e está disponível a um custo baixo para os pesquisadores compararam a um sistema de laser Ti-Safira. Comparado a um sistema Ti-Safira, no entanto, o laser Micropoint é esperado para causar danos a uma área maior, que pode ser desvantajoso para algumas aplicações. Se um sistema Ti-Safira é desejado, um protocolo excelente na construção de um sistema deste tipo está disponível 12. O protocolo atual pode ser realizada em uma variedade de neurônios em C. elegans, no entanto, notamos que as diferenças na capacidade regenerativa entre tipos distintos de neurônios são esperados 13. Além disso, diferentes origens transgênicos podem afetar o sucesso regenerativo. Embora a percentagem de regeneração de neurônios GABA é bastante consistente entre diferentes linhagens transgênicas marcador, temos notado um aumento global leve em regeneração em juIs76 14 vs 15 oxIs12 worms. Diferenças entre os marcadores dos neurônios toque também foram descritos 2. Nós preferimos a imobilizar o worms com microesferas, em vez de anestésicos como as contas resultam em mais rápido e mais consistente imobilização 16. Este também é vantajosa, somos capazes de observar a regeneração livre de quaisquer possíveis efeitos de confusão devido à anestesia 17. Um método anestésico sem alternativa para a imobilização é o uso de dispositivos microfluídicos. O uso de microfluídica para axotomia tem sido amplamente descrito 17-22. Nós achamos que com o uso consistente, as funções de laser melhor quando a cumarina 440 na célula corante é alterada uma vez por semana seguindo o procedimento descrito no manual Micropoint. Se necessário, o controle deslizante de atenuação pode ser usado para aumentar a potência, mas isso pode ser uma indicação de tinta velha ou desalinhamento laser. Além disso, a célula de corante tem uma vida útil limitada e, eventualmente, precisam ser reconstruídos ou substituídos (Ver Troubleshooting). Pode ser difícil de manobrar a neurite alvo sob a mira que marcam o foco do laser, principalmente se o animal não é completamente paralisado. Nós achamos que uma etapa manual não é ideal para este fim, embora seja certamente útil. Um palco joystick controlado motorizada é mais precisa, e nós achamos que usar o software que suporta a imagem arrastando com o mouse para mover o palco motorizado é o melhor. Elementos Nikon oferece esse recurso e é descrito neste protocolo, mas o pacote micromanager livre, assim como outros software de imagem, pode ter uma funcionalidade semelhante. Uma forma diferente de segmentação fina é para mover o foco do laser, em vez do animal. Um galvanômetro mecanismo de direção do feixe está disponível como um add-on para o laser Micropoint, se esta abordagem é preferido. Além de sua aplicação ao estudo da regeneração neuronal, o laser pode ser utilizado para ablação outros tipos de células, tais como pele, músculo, ou células especializadas, ou interromper sinapses neuronais específicos 23-27. Além disso, as vias que regulam a degeneração de neurônios que acompanha a lesão ou doença poderia ser investigado com este sistema. Como tal, o uso de lasers pulsados ​​continuará a lançar luz sobre ambos os fatores genéticos e as mudanças de células biológicas que facilitam a regeneração neuronal e outros processos relevantes. Solução de problemas: Aqui descritos são alguns problemas comuns e suas soluções associadas. <ol type="a"><li> O laser não é cortar corretamente. Isto é provável porque nem a laser está fora de foco (ver secção 2), ou a tinta corante na célula precisa ser substituído (ver Micropoint manual). Alternativamente, a célula de corante podem precisar ser substituídos ou reconstruídos. </li><li> Os vermes estão se movendo em agarose pad. Este é geralmente um sinal de que o bloco de agarose é muito úmido. Nós achamos que as almofadas devem ser deixados por aproximadamente 30 segundos antes de worms são colocados sobre eles para contornar este problema. Você também pode tentar usar o menor tamanho (0,05 mm) microesferas. </li><li> A recuperação de vermes é difícil e ineficiente. Isso pode ser causado pela remoção lamela incorreto ou por um bloco de agarose seca. Se o bloco é muito seco, você pode perceber que os axônios desenvolver uma aparência frisada. Em alguns casos, isso acontece porque os vermes não foram colocados no bloco logo depois que ele foi feito. Alternativamente, um estoque antigo de solução de agarose podem ter uma concentração superior a 3% após o derretimento repetido. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 0,05 mM esferas de poliestireno </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> 0,10 mM esferas de poliestireno </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose GPG / LE </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> 00972 </td><td> Ultra pura </td></tr><tr><td> Falcon 14 ml Tubo de poliestireno de fundo redondo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 mm estilo, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Plain lâminas de microscópio precleaned </td><td> Erie Empresa Scientific </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm N º 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> Kimwipes KIMTECH Ciência </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm Estilo Petri Dish </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Fita em branco 3/4W x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo de imersão </td><td> Nikon </td><td></td><td> Tipo A, nd = 1,515 </td></tr><tr><td> EG1285 ou CZ1200 </td><td> C. elegans Centro de Genética </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> ANTES Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements-Ar ou Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micropoint Sistema Laser Ablation </td><td> Fotônicos Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio composto </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Camera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> Modelo C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC com Intel Core 2 Duo </td><td> Dell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Versão de 2002, Série Pack 3 </td></tr><tr><td> Dupla seca banho Incubadora </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Controles analógicos </td></tr><tr><td> 4X Plano Fluor objetivo </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Plano de Apo objetivo de petróleo VC </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 forceps </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dicas Dumoxel padrão, também pode usar # 7 </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> NI-150 com Iluminador de Alta Intensidade </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

Os neurônios se comunicam com outras células através de axônios e dendritos, extensões de membrana delgada que contêm especializações pré ou pós-sináptica. Se um neurônio é danificado por lesão ou doença, ele pode se regenerar. Fatores de células-intrínsecos e extrínsecos influenciam a capacidade de um neurônio para regenerar e restaurar a função. Recentemente, o nemátodo C. elegans tem emergido como um organismo modelo excelente de identificar genes e vias de sinalização que influenciam a regeneração dos neurônios 1-6. A principal forma de iniciar a regeneração neuronal em C. elegans é mediada por laser de corte, ou axotomia. Durante a axotomia, um processo marcado fluorescente neuronal é cortado usando pulsos de alta energia. Inicialmente, regeneração neuronal em C. elegans foi examinado usando um laser de femtosegundos amplificada 5. No entanto, estudos de regeneração posteriores mostraram que um laser pulsado convencional pode ser usado para cortar com precisão os neurônios in vivo e provocar uma resposta semelhante regenerativa 1,3,7. Nós apresentamos um protocolo para a realização in vivo de laser em axotomia o worm usando um Micropoint pulsada a laser, um sistema de turnkey que está prontamente disponível e que tem sido amplamente utilizada para a ablação de células-alvo. Descrevemos alinhando a laser, montagem dos vermes, o corte de neurônios específicos, e avaliar a regeneração subseqüente. O sistema fornece a capacidade de cortar um grande número de neurônios em worms múltiplos durante um experimento. Assim, laser axotomia como descrito aqui é um sistema eficiente para iniciar e analisar o processo de regeneração.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Um protocolo para cortar neurônios<em&gt; C. elegans</em&gt; Com um Micropoint laser pulsado é apresentado. Descrevemos configurar o sistema, imobilizando worms, e cortando os neurônios marcados. As vantagens incluem um sistema de custo relativamente baixo ea possibilidade de romper processos neuronais ou células ablação<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.2K visualizações.  Yale University School of Medicine. Um protocolo para cortar neurônios C. elegans Com um Micropoint laser pulsado é apresentado. Descrevemos configurar o sistema, imobilizando worms, e cortando os neurônios marcados. As vantagens incluem um sistema de custo relativamente baixo ea possibilidade de romper processos neuronais ou células ablação In vivo.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...