Este protocolo visa obter RNAs específicos de tipos celulares de alta qualidade a partir de um pequeno número de células em um tecido complexo sem classificação celular. Ele emprega um modelo de rato recentemente disponível que permite aos pesquisadores isolar um RNAs ligados ao ribossomo usando GLP pull down. O método também é adequado para isolar RNAs ligados a ribossomos de quaisquer células que expressem EGFP.
Para começar, adicione dois mililitros de tampão de trabalho de homogeneização gelado a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto. transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros e centrifugar a 12.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros sem perturbar o pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar o sobrenadante com o anticorpo anti-GFP a quatro graus Celsius em um rotador de extremidade sobre extremidade durante a noite. Transfira a mistura de homogeneizados e anticorpos para um novo tubo de fundo redondo de dois mililitros contendo grânulos de proteína g lavados e incubado quatro graus Celsius no rotador a 24 RPM por duas horas.
Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a fração negativa que contém os RNAs em células negativas EGFP e os RNAs em células positivas EGFP que não estão ligadas a ribossomos. Adicione um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas.
Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético. Remova o tampão de lavagem e repita as etapas de lavagem mais duas vezes para obter o complexo de RNA ribossomo de contas de células positivas para EGFP. Incubar as contas com 50 microlitros de tampão de extração do kit de isolamento de RNA em um ThermoMixer por 30 minutos para liberar RNAs das contas.
Separe as contas com um rack magnético e transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 3000 g durante dois minutos. Em seguida, pipete o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.
Para pré-condicionar a coluna de purificação de RNA, pipete 250 microlitros de tampão condicionante para a coluna de purificação e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a coluna a 16 000 g durante um minuto. Pipetar um volume igual de etanol a 70% para o extracto da célula e misturar bem por pipetagem.
Pipetar até 200 microlitros da mistura para a coluna de purificação de RNA pré-condicionada. Para reduzir a perda de amostras não encher a coluna mais de 80% da sua capacidade. Repita esta etapa várias vezes até que todos os RNAs sejam coletados na mesma coluna de cada fração.
Centrifugar a coluna por dois minutos para ligar o RNA à membrana na coluna. Em seguida, continue a centrifugação por 30 segundos. Descarte o fluxo através e pipete 100 microlitros de tampão de lavagem um na coluna.
Centrifugar por um minuto e, em seguida, descartar o fluxo. Pipeta 75 microlitros de solução de DNA misturam-se diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos.
Em seguida, pipete 40 microlitros de tampão de lavagem um na coluna e centrifugar por mais 30 segundos. Descarte o fluxo. Pipetar 100 microlitros de tampão de lavagem dois para a coluna e centrifugar a 8 000 g durante um minuto.
Descarte o fluxo. Compre PET 100 microlitros de tampão de lavagem dois na coluna e centrífuga a 16.000 g por dois minutos. Descarte o fluxo e recentrifugar a mesma coluna a 16.000 g por um minuto para remover todos os vestígios de tampão de lavagem.
Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. pipeta 12 microlitros de água livre de RNase diretamente na membrana da coluna de purificação, garantindo que a ponta da pipeta não toque na membrana. Incubar à temperatura ambiente durante um minuto e centrifugar a 1000 g durante um minuto.
Em seguida, a 16.000 G por um minuto para eluir o RNA. Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA extraído. Armazene os RNAs em um freezer de 80 graus ou envie para uma análise mais aprofundada.
Ratos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados, Gli1-CreERT2 e NuTRAP, somos injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias para três injeções. A análise de imunofluorescência dos tecidos coletados mostra que o EGFP foi expresso em células intersticiais nos testículos. O EGFP também foi encontrado em células capsulares adrenais em camundongos Gli1-CreERT2, NuTRAP.
Em Sonic Hedgehog-CreERT2, camundongos NuTRAP A população de células positivas para EGFP reside no córtex externo da glândula adrenal sob a cápsula, confirmando a expressão de células pré-expressas de EGFP. Após a extração dos RNAs específicos do tipo celular, o RNA extraído foi enviado para análise de microarray. Os resultados mostraram que cerca de 3000 genes foram enriquecidos na fração positiva, em comparação com os genes na fração negativa, enquanto cerca de 4.000 genes foram enriquecidos na fração negativa.
Dentre os genes diferenciais expressos, os genes associados às células de Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 foram enriquecidos na fração positiva. Na fração negativa, os genes associados à célula de Sertoli Ouriço do Deserto e Gstm6 foram enriquecidos. Apenas alguns genes diferencialmente expressos foram identificados na comparação da fração negativa com a entrada.
RT-PCR quantitativo em tempo real foi utilizado para confirmar a expressão de genes-chave nas frações positiva e negativa. Semelhante ao que foi encontrado no ensaio de microarray, as enzimas esteroidogênicas 3-beta hidroxi esteroide desidrogenase e a enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol foram enriquecidas na fração positiva. Enquanto isso, o marcador de células de Sertoli SRY box transcription factor nine e o marcador de células germinativas synaptonemal complex protein three foram enriquecidos na fração negativa.
Ao tentar este protocolo, é importante preparar o tampão de trabalho de homogeneização fresco Adicionar TDT, riboniceração recombinante ciclo-heximida e coquetel inibidor de proteinase à solução de estoque de homogeneização somente antes do uso. Também é importante preparar o baixo teor de sal fresco e os tampões de lavagem com alto teor de sal antes do uso.
