A dinâmica global da cromatina tem se mostrado um importante mediador de vários estados da doença, como câncer e envelhecimento. Nosso protocolo fornece um modelo fisiologicamente relevante para estudar esse processo. A análise laboratorial padrão das modificações pós-translacionais de histone ou PTMS é geralmente limitada à sondagem para um único PTM de cada vez usando ensaios baseados em anticorpos.
A análise de espectrometria de massa da cromatografia líquida da histona PTMS nos permite medir a abundância de centenas de PTMS em um único experimento. Demonstrando o procedimento estarão Stephanie Stransky, Ronald Cutler e Julie Kim, pós-doutora, estudante de pós-graduação e tecnologia de pesquisa, respectivamente, do laboratório. Primeiro, usando mídia de crescimento padrão, cresça as células como uma monocamada até que elas sejam 80% confluentes.
Em seguida, lave as células com HBSS. Adicione cinco mililitros de 0,05% trypsin-EDTA diluídos no HBSS. Incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Use um microscópio para verificar o desprendimento celular. Depois de contar as células, diluir a suspensão celular com nova mídia de crescimento. Adicione 0,5 mililitros de mídia de crescimento para equilibrar uma placa inferior de 24 poços com vários micro-poços em cada.
Em seguida, centrifufique as placas a 3000 x g para remover bolhas de ar da superfície da placa. Agora transfira a suspensão celular previamente feita para a placa de 24 poços e centrífuga por três minutos a 120 x g. Verifique as células na placa de 24 poços e, em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para formação de esferoides.
Enquanto isso, para equilibrar o bioreator, adicione 25 mililitros de água estéril à câmara de umidade e nove mililitros de mídia de crescimento à câmara celular. Incubar o bioreator em uma incubadora rotativa de clinostat por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Retire os esferoides da placa de 24 poços de fixação ultra baixa, pipetando suavemente usando um mililitro de pontas de furo largo, e transfira-os para um prato de cultura de tecido.
Para selecionar esferoides suficientemente formadores, verifique a qualidade dos esferoides sob um microscópio. Spheroids de boa qualidade têm tamanho uniforme, compactação e arredondamento. Encha o bioreator equilibrado com cinco mililitros de mídia de crescimento fresco, e transfira os esferoides para ele.
Em seguida, encha o bioreator completamente com novas mídias de crescimento e coloque o bioreator na incubadora de clinostat de 10 a 11 RPM. A cada dois ou três dias, trocam a mídia de crescimento substituindo 10 mililitros da mídia antiga por mídia fresca. À medida que este spheroids aumenta em tamanho e número, aumente a velocidade de rotação da incubadora.
Depois de obter a pelota esferoide, adicione cinco volumes de ácido sulfúrico molar frio de 0,2 molar à pelota e pipeta para cima e para baixo para interromper a pelota e soltar histones. Uma vez que o supernante é obtido após a centrifugação, adicione ácido tricloroacético concentrado a frio, de tal forma que a concentração final se torne 25 a 30% de volume em volume. E misture invertendo o tubo algumas vezes e centrífuga como descrito no manuscrito.
Depois de descartar o supernatante, usando uma pipeta de pasto de vidro, lave a pelota e as paredes do tubo com aproximadamente 500 microliters de acetona fria e ácido clorídrico de 0,1%, e depois centrífuga a 3.400 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, vire o tubo para descartar o supernatante. Usando uma pipeta de pastagem de vidro, adicione 500 microliters de acetona 100% fria para lavar a pelota e a centrífuga, como demonstrado anteriormente.
Depois de descartar o supernasce, remova completamente a acetona por pipetar cuidadosamente, e deixe a amostra secar com uma tampa aberta por cerca de 20 minutos. Resuspenja a pelota em 20 microlitres de 15 a 20% de acetonitrilo em um bicarbonato de amônio de 100 milimônios de pH 8. Após o vórtice, gire a suspensão a 1000 x g por 30 segundos.
Para oito ou mais amostras, transfira cada amostra suspensa para uma placa de 96 poços. Em seguida, em um capô, adicione dois microliters de anidrido propiônico e misture por pipetação cinco vezes. Adicione rapidamente 10 microliters de hidróxido de amônio e misture por pipetação cinco vezes.
Misture a resina HLB em uma placa de agitação magnética. Em seguida, adicione 70 microliters da suspensão HLB a cada poço de uma placa de filtro de 96 poços em uma placa de coleta de 96 poços. Após descartar o fluxo, lave a resina com 100 microlitres de ácido trifluoroacético de 0,1%.
Após reaprgerentar cada amostra em 100 microlitres de ácido trifluoroacético de 0,1%, carregue cada amostra em cada poço e evite espirrar usando um vácuo. Depois de descartar o fluxo, lave as amostras com 100 microlitres de ácido trifluoroacético de 0,1% e coloque a placa do filtro em uma nova placa de coleta. Em seguida, adicione 60 microliters de 60% de acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1% a cada poço e evite espirrar usando vácuo.
Colete o fluxo através e seque em um vácuo de velocidade. Carregue a placa de coleta seca no HPLC e execute o método LC/MS/MS conforme descrito no manuscrito. Neste estudo, observou-se a abundância relativa de modificações pós-translacionais de histona comum em hepatocitos C3A cultivados como esferoides tridimensionais.
Modificações pós-translacionais também poderiam ser observadas em um único resíduo em peptídeos gerados a partir de proteínas histonas. O tratamento dos esferoides com butirato de sódio aumentou a abundância relativa de acetilação de histona, enquanto que com succinato de sódio aumentou a succinylation de resíduo de histona. O método também demonstrou o padrão de distribuição da acetilação de histona após o tratamento de butirato de sódio e o de succinylation de histona após o tratamento com succinato de sódio.
O resultado também mostrou padrões comuns de diferentes modificações de histona. Os tratamentos de butirato de sódio aumentaram significativamente a acetilação do resíduo de lysina 14 em um peptídeo gerado a partir da proteína histona H3, somente quando seu nono resíduo de lysina tinha dois grupos de metila, mas não um ou três grupos de metila. As abundâncias relativas de modificações individuais e várias combinações de modificações pós-translacionais no peptídeo derivado de H3 também foram calculadas.
Padrões combinatórios de modificações pós-translacionais após o tratamento de butirato de sódio também foram observados em um peptídeo gerado a partir da proteína histona H4. Aqui também, o tratamento de butirato de sódio resultou em um aumento significativo na acetilação. Atenção crítica deve ser colocada sobre manter os esferoides no banco o mínimo possível e em um passo desalado para evitar derramamento de amostras. Este fluxo de trabalho pode ser usado para explorar a cromatina em tecidos sólidos usando um modelo mais fisiológico do que replicar rapidamente culturas de células planas.
