Este modelo estimula estímulos biomecânicos experimentados por células musculares lisas na aorta humana. Combinado com células derivadas de pacientes, este sistema pode ser usado para triagem de drogas e medicina personalizada de doenças da aorta. Este modelo pode imitar e controlar com precisão os parâmetros mecânicos nus das células musculares lisas na aorta humana, o que fornece uma nova plataforma in vitro para o estudo e patogênese de doenças da aorta.
Demonstrando o procedimento estará Mieradilijiang Abudubat, um médico cartaz do nosso laboratório. Comece lavando a região lateral direita da aorta ascendente com pbs estéreis, uma ou duas vezes. Remova as camadas íntima e adventícia do tecido com duas pinças oftálmicas e retenha a camada média para colher as células.
Coloque a camada de mídia em um prato de 10 centímetros e corte-a em pedaços de dois a três milímetros. Em seguida, adicione cinco mililitros de SMCM contendo 10%fbs e 1% de penicilina estreptomicina às amostras de tecido. Mova o pequeno tecido para o frasco de cultura com um conta-gotas estéril, espalhando o tecido uniformemente.
Descartar o meio de cultura o máximo possível. Em seguida, inverta a garrafa de cabeça para baixo. Adicione dois mililitros de SMCM no frasco de cultura invertida e coloque-o na incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma a duas horas.
Em seguida, vire-o lentamente para o lado direito e adicione mais dois mililitros de SMCM. Após cinco a sete dias de incubação, troque o SMCM por quatro mililitros de SMCM fresco. Descarte lentamente e adicione o SMCM ao alterar o meio.
Geralmente, as células musculares lisas esporádicas saem em aproximadamente duas semanas. Transportar o frasco de cultura suavemente ao se mover para uma estação de microscópio. Caso contrário, os tecidos flutuarão e as células crescerão lentamente.
Quando as células crescerem, divida-as em duas novas garrafas de cultura com quatro mililitros de SMCM fresco. Identificar as células através de uma análise de imunofluorescência de quatro marcadores específicos para células musculares lisas. Para polimerizar o PDMS, adicione o agente de cura ou o componente B à base ou ao componente A e misture o complexo por cinco minutos.
O volume dependerá da necessidade do estudo. Coloque o gel PDMS preparado em um tanque de extração a vácuo por 30 a 60 minutos e mantenha a pressão abaixo de 0,8 mili pascals negativos. Usando software de design assistido por computador, projete o molde.
Personalize os moldes das três camadas usando uma máquina de gravação de controle numérico computadorizado de alta precisão. Depois de esculpir a estrutura dos moldes e os microcanais usando placas de PMMA, cole-os em outra placa. Despeje o gel PDMS preparado em um molde projetado.
Em seguida, cross-link a 70 graus Celsius por uma a duas horas. Retire as placas PDMS reticuladas do molde e corte as membranas PDMS comercializadas em seções de 100 milímetros por 40 milímetros. Faça furos nas três lajes de PDMs usando um perfurador de furo de um milímetro para fazer a entrada e saída de ar e microcanais médios no chip PDMS.
Trate as três placas PDMS preparadas e duas membranas PDMS com plasma de oxigênio por cinco minutos para ativação da superfície do PDMs. Ajuste o ar ambiente para processar gás, a pressão para 100 kilopascals negativos, a corrente para 180 a 200 miliamperes de píeres, a tensão para 200 volts e o tempo de processamento para cinco minutos. Ligue três placas PDMS e duas membranas PDMS juntas sob um microscópio estereoscópico, de modo que a camada superior consista na laje PDMS do canal de ar e, em seguida, na membrana PDMS.
O canal médio consiste na laje PDMS, depois na membrana PDMs e a camada inferior é a laje PDMS do canal de ar. Coloque o chip PDMS montado em uma incubadora de 70 graus Celsius por uma hora. Prepare várias mangueiras de látex de um milímetro de diâmetro interno e três centímetros de comprimento.
Insira uma agulha de aço inoxidável de um milímetro de diâmetro externo e um centímetro de comprimento em uma extremidade da mangueira preparada. Em seguida, insira uma isca na outra extremidade da mangueira para criar o tubo conectado ao ar e aos microcanais médios do chip PDMS. Insira os tubos preparados nas saídas e entradas do ar e microcanais médios no chip PDMS.
Infundir dois mililitros de 80 miligramas por mililitro de colágeno de rato no microcanal médio do chip PDMs, usando uma seringa de dois mililitros, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, remova o colágeno do canal com uma seringa de dois mililitros. Coloque os chips PDMS codificados de colágeno em uma incubadora Celsius de 60 graus durante a noite.
Coloque os chips PDMS em um esterilizador UV por mais de uma hora. Coloque os chips PDMS esterilizados em uma bancada ultra limpa em preparação para o experimento celular. Cultura de quatro vezes 10 para as cinco células musculares lisas aórticas humanas primárias de pacientes usando SMCM contendo 2%FBS e 1% de estreptomicina de penicilina em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%, fixada em 37 graus Celsius.
Quando a densidade das células musculares lisas atingir 80%, descarte o SMCM e lave as células com dois mililitros de PPS. Digerir as células usando um mililitro de tripsina a 0,25% por dois minutos e centrifugar a 100 RCF por cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de SMCM fresco.
Use oito mililitros de SMCM para cultivar as células em um prato de cultura de 10 centímetros. Usando um citômetro, calcule o número de células e prossiga com a concentração final de duas vezes 10 para as cinco células por mililitro. Despeje lentamente dois mililitros de PBS no microcanal médio do chip PDMS codificado e esterilizado com colágeno e depois descarte usando uma seringa de dois mililitros.
Despeje lentamente dois mililitros de duas vezes 10 para as cinco células por mililitros de suspensão de células musculares lisas no microcanal de mídia do chip PDMS. Em seguida, feche a isca na entrada e saída do chip PDMS. Coloque o chip PDMS em uma incubadora, ajustado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por um dia.
Após a incubação, quando as células estiverem ligadas à membrana PDMS no chip PDMS, conecte a saída do microcanal de ar no chip PDMS ao sistema controlador de vácuo. Uma forma celular normal alongada será vista sob o microscópio quando a célula estiver ligada. Contrastando com as células redondas suspensas.
Ligue a válvula solenoide e a bomba de vácuo. Abra o regulador de vácuo e ajuste o nível de pressão dependendo das deformações. Em seguida, coloque os chips PDMS e uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Prepare várias válvulas solenoides, filtros de vácuo, reguladores de vácuo, uma bomba de vácuo, uma bomba peristáltica e um PLC controlando a válvula solenoide. Programe o controlador PLC e defina o intervalo de tempo de desligamento para um hertz. Conecte as válvulas solenoides ao controlador programado.
Conecte a entrada da bomba de vácuo aos filtros de vácuo e, em seguida, conecte a saída dos filtros de vácuo aos reguladores de vácuo. Conecte a saída dos reguladores de vácuo às válvulas solenoides. E, finalmente, conecte a saída das válvulas solenoides às saídas dos microcanais de ar dos chips PDMS.
Conecte a saída da bomba peristáltica à entrada do microcanal médio do chip PDMS e a entrada da bomba peristáltica à saída do chip PDMS de microcanal médio para substituição do meio de cultura e manuseio de medicamentos. Ajuste a amplitude da deformação pelo regulador e a frequência da deformação pelo microcontrolador. A viabilidade da linhagem de células musculares lisas da aorta humana, CRL 1990, no chip PDMS, foi estimada usando um ensaio vivo e morto no terceiro e quinto dia de cultura celular.
A viabilidade celular foi superior a 90% no terceiro e quinto dias. A coloração F-actina do citoesqueleto do LCR 1990, no chip PDMS, mostrou morfologia celular normal e células alinhadas perpendicularmente à cepa após alongamento por 24 horas. A imunofluorescência dos marcadores contráteis SM22 e CNN1 foi maior sob condições de deformação em comparação com as condições estáticas.
Além disso, os genes SM22 e CNN1 foram regulados em condições de tensão das células musculares lisas. A coloração com actina F do BAV e TAV, aneurisma da aorta torácica e dissecção de células musculares lisas primárias da aorta humana derivadas do paciente, mostraram morfologia celular normal e células alinhadas perpendicularmente à direção da deformação após o alongamento por 24 horas. A fluorescência SM22 e CNN1 no aneurisma e dissecção da aorta torácica BAVTAAD e TAV foram maiores sob condições de deformação do que em condições estáticas.
Semelhante aos níveis de expressão gênica de SM22 e CNN1, que também foram regulados positivamente em condições de deformação em comparação com condições estáticas. Deve-se prestar atenção ao princípio da esterilidade ao isolar o CMSA primário. Depois que os laboratórios PDMS e as membranas são tratados com plasma, as superfícies não devem ser sujas.
Com base neste protocolo, as células endoteliais podem ser co-cultivadas com células musculares lisas e o estresse puro pode ser dado às células com tensão cíclica para simular ainda mais forças mecânicas.
