Bu yöntem, protein-protein etkileşimindeki soruları cevaplamaya yardımcı olabilir, canlı hücre içinde birbirinden 10 nanometre içinde bulunan iki proteini doğrudan tespit etmemizi sağlayacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve çoğaltılması kolay olmasıdır. Ayrıca birçok modern laboratuvarda bulunan basit malzemeler gerektirir.
Bu önlem, ilgili proteinde geçiş yoluyla yayılan herhangi bir canlı doku veya kültür hücresi ile kullanılabilir. Bu tekniği ilk kez kullanıyorsanız, önce sistemi test etmek için pozitif kontrolü ve negatif kontrolü kullanmanız önerilir. Başlamak için, Nicotiana benthamiana tohumlarını yüksek yoğunlukta ıslak toprak içeren bir tencereye ekin.
Ekilen tohumları 23 santigrat dereceye ayarlanmış bir büyüme odasında tutun. Öfilin çapı 0,3 ila 0,5 santimetreye ulaştığında, fideleri daha büyük saksılara aktarın ve aynı odada aynı parametrelerle büyümelerine izin verin. Daha sonra, FRET yapılarını içeren her bir agrobakteri kolonisini, antibiyotikler ve 150 mikromolar asetosirengon ile desteklenmiş beş mililitre LB ortamında aşılayarak agroinfiltrasyon için bakteri hücreleri hazırlayın.
Kültürü bir gecede 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3.000 G'de santrifüj edin. Agroinfiltrasyon tamponundaki hücreleri 0.5'lik bir OD 600'e yeniden askıya alın.
Çift yapı agroinfiltrasyonu için, yeniden askıya alınan hücreleri bire bir hacim oranında uygun yapıları barındıran hücrelerle birleştirin. Hücreleri 30 dakika ila bir saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Agroinfiltrasyon yapmak için, bakteri kültürünü bir mililitrelik iğnesiz bir şırıngaya yükleyin.
Yavaşça ama sıkıca şırınganın nozulunu tamamen genişlemiş Nicotiana benthamiana yapraklarının abaxial tarafına bastırırken, yaprağı adaksiyal tarafta eldivenli bir parmakla tutun. Bir yaprak üzerinde dört noktaya kadar sızın, bitki başına üç yaprak ve her bakteri kültürü için iki veya üç bitki için. Agrosızmış bitkileri, 24 ila 36 saat boyunca daha önce tarif edildiği gibi aynı koşullar altında aynı büyüme odasında tutun.
24 ila 36 saatlik infiltrasyondan sonra, her tarımsal sızmış yaprağı damarlar arasında iki ila dört milimetrelik küçük parçalara ayırmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Yaprak parçalarını, abeksenel yaprak yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin. Yaprak parçalarına bir damla su koyun ve kapak camıyla örtün.
Hava kabarcıklarını gidermek için kapak camına hafifçe dokunun. Ardından mikroskop ve lazeri açın. Slaytı mikroskop sahne tutucusuna yerleştirin.
SE-FRET parametrelerini ayarlamak için çok boyutlu alma aracını açın. Ardından, donör florokrom GFP'nin uyarılması ve emisyonu için donör kanalını 405 nanometrelik bir uyarma lazerinde ve emisyon filtresini 400 ila 597 nanometrede ayarlayın. Alıcı florokrom mRFP'nin uyarılması ve emisyonu için alıcı kanalı ve 561 nanometrelik bir uyarma lazerini ve emisyon filtresini 400 ila 597 nanometrede ayarlayın.
FRET kanalını, 405 nanometre uyarma lazeri ve 597 ila 617 nanometre emisyon filtresi ile vericinin uyarılması ve alıcı florokromların emisyonu için ayarlayın. Fotobeyazlatmadan kaçınırken FRET'yi gözlemlemek için donör uyarma yoğunluğunu minimum seviyeye ayarlayın. Donörü uyarın ve alıcının beklenen floresan sinyalini içeren hücreleri tarayın.
İlgilenilen floresan sinyalini içeren bölgeyi seçin. Tutturma düğmesine basarak bir SE-FRET görüntü dizisi edinin. AB-FRET parametrelerini ayarlamak için, SE-FRET için ayarlanan donör ve alıcı kanal parametrelerini kullanın, ancak FRET kanalını kapatın.
Ardından, alıcı mRFP'nin fotobeyazlatılması için parametreleri ayarlamaya hazırlanın. Beyazlatmanın beş görüntüden sonra başladığından emin olun. Her alan ağartıcısı için 200 yinelemeye izin verin.
% 100 lazer yoğunluğunu 561 nanometrede tutun. Beyazlatma süresini 45 saniye koruyun. 400 hertz'de 512 x 512 piksel tarama hızı sağlayın.
Ağartılacak hücrenin bölgesini arayıp çizin ve deneyi başlat düğmesine basarak ağartmayı etkinleştirin. Pozitif kontrol durumunda, beş görüntüden sonra, beyazlatma başlar ve ilgi alanı yeşile döner. GFP'ninki artarken mRFP'nin yoğunluğunun azaldığını doğrulamak için ortalama YG'yi kontrol edin.
Alternatif olarak, mRFP'nin ağarttığını ve GFP'nin arttığını gösteren düzeni kontrol edin. SE-FRET verilerini analiz etmek için ImageJ yazılımını kullanın. Görüntüleri açın ve yalnızca bir bağışçı yığını oluşturun.
Görüntüleri sekiz bit olarak TIF dosyası olarak kaydedin. Benzer şekilde, yığını yalnızca alıcı için oluşturun, ardından birleşik bir donör ve alıcı yığını oluşturun. Ardından, SE-FRET verimliliğinin görüntülerini oluşturmak için PixFRET eklentisini kullanın.
Oluşturulan yığınları açın ve spektral kanamayı çıkardıktan sonra düzeltilmiş FRET görüntülerini oluşturun. Görüntüyü sahte renkli görüntü olarak sunun. AB-FRET verilerini analiz etmek için, bu formülü kullanarak mRFP fotobeyazlatma işleminden sonra GFP emisyonundaki yüzde artış olarak yüzde AB-FRET hesaplayın.
Histon deubikitinaz OTLD1'in transkripsiyon faktörü LSH10 ile spesifik protein-protein etkileşimi SE-FRET tarafından incelendi. Hücre çekirdekleri aynı anda üç kanala kaydedildi ve SE-FRET verimliliğini göstermek için bir sahte renk ölçeği oluşturuldu. Maviden kırmızıya geçiş, FRET verimliliğinde ve protein-protein yakınlığında bir artışa karşılık gelir.
LSH10 ve OTLD1'in birlikte ekspresyonunu takiben SE-FRET yoğunluğu, pozitif kontrol mRFP-GFP için gözlemlenenlerle karşılaştırılabilirdi. OTLD1, mRFP ve LSH4-GFP'nin birlikte ekspresyonu veya serbest mRFP ve LSH10-GFP gibi negatif kontrollerde SE-FRET gözlenmedi. AB-FRET görüntüleri, LSH10-GFP ve OTLD1-mRFP'nin birlikte ekspresyonunun, RFP alıcısı fotobeyazlatıldıktan sonra GFP donör floresansının artmasına neden olduğunu göstermiştir.
Donör floresansında benzer bir artış pozitif kontrolde gözlendi, ancak alıcı floresan inaktive edildiğinde negatif kontrollerde gözlenmedi. AB-FRET verilerinin kantitatif analizi, LSH10 ve OTLD1'i birlikte ifade ettikten sonra donör floresansında istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir. Pozitif kontrol yaklaşık% 30'luk bir yüzde AB-FRET üretirken, negatif kontroller hiç üretmedi.
SE-FRET ve AB-FRET, hücre çekirdeğinde, transkripsiyon faktörü histon modifiye edici enzim komplekslerinin hücre altı lokalizasyonu ve GFP-MRFP proteinlerinin nükleositoplazmik doğası ile tutarlı bir sinyal gösterdi. Protokolü takip etmeden önce hatırlanması gereken en önemli şey, konfokal nanoskopi modeline bağlı olarak doğru donör alıcı ekspres çiftini test etmektir. Çalıştırdıktan ve yinelememizi yaptıktan sonra, sonuçları almak için yalnızca 24 ila 36 saat gerekir.
Bu videoyu izledikten sonra, protein-protein etkileşimini incelemek için FRET tekniğinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.
