Diese Methode kann helfen, die Fragen in der Protein-Protein-Interaktion zu beantworten, wird es uns ermöglichen, zwei Proteine, die sich innerhalb von 10 Nanometern voneinander in lebenden Zellen befinden, direkt zu erkennen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach und leicht zu reproduzieren ist. Es erfordert auch einfache Materialien, die in vielen modernen Labors verfügbar sind.
Dieses Maß kann mit jedem lebenden Gewebe oder jeder Kulturzelle verwendet werden, die sich vorübergehend an einem interessierenden Protein ausbreiten. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal verwenden, wird empfohlen, dass Sie zuerst die Positivkontrolle und die Negativkontrolle verwenden, um das System zu testen. Um zu beginnen, säen Sie Nicotiana benthamiana Samen in einem Topf mit nasser Erde in hoher Dichte.
Bewahren Sie die gepflanzten Samen in einer Wachstumskammer auf, die auf 23 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn der Durchmesser des Euphylls 0,3 bis 0,5 Zentimeter erreicht, übertragen Sie die Sämlinge in größere Töpfe und lassen Sie sie in derselben Kammer mit den gleichen Parametern wachsen. Als nächstes bereiten Sie Bakterienzellen für die Agroinfiltration vor, indem Sie jede Agrobakterienkolonie, die die FRET-Konstrukte enthält, in fünf Milliliter LB-Medium beimpfen, ergänzt mit Antibiotika und 150 Mikromolaren Acetosyringon.
Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen bei 3.000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen im Agroinfiltrationspuffer auf einen OD 600 von 0,5.
Für die Agroinfiltration mit doppeltem Konstrukt kombinieren Sie die resuspendierten Zellen in einem Volumenverhältnis von eins zu eins mit Zellen, die die entsprechenden Konstrukte beherbergen. Inkubieren Sie die Zellen bei 28 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde. Um eine Agroinfiltration durchzuführen, laden Sie die Bakterienkultur in eine nadellose Spritze mit einem Milliliter.
Drücken Sie die Düse der Spritze vorsichtig, aber fest gegen die abaxiale Seite der vollständig expandierten Nicotiana benthamiana Blätter, während Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf der adaxialen Seite halten. Infiltrieren Sie bis zu vier Flecken auf einem Blatt, drei Blätter pro Pflanze und zwei oder drei Pflanzen für jede Bakterienkultur. Halten Sie die agroinfiltrierten Pflanzen 24 bis 36 Stunden lang in derselben Wachstumskammer unter den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben.
Nach 24 bis 36 Stunden Infiltration schneiden Sie jedes agroinfiltrierte Blatt mit einer Rasierklinge in kleine Stücke von zwei mal vier Millimetern zwischen den Venen. Legen Sie die Blattstücke auf einen Glasobjektträger, wobei die abaxiale Blattoberfläche nach oben zeigt. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf die Blattstücke und bedecken Sie sie mit dem Deckglas.
Klopfen Sie leicht auf das Deckglas, um Luftblasen zu entfernen. Schalten Sie dann das Mikroskop und den Laser ein. Legen Sie den Objektträger in den Mikroskoptischhalter.
Um die Parameter für SE-FRET einzurichten, öffnen Sie das mehrdimensionale Erfassungswerkzeug. Stellen Sie dann den Donorkanal für die Anregung und Emission des Spenderfluorochroms GFP bei einem Anregungslaser von 405 Nanometern und den Emissionsfilter auf 400 bis 597 Nanometer ein. Stellen Sie den Akzeptorkanal für die Anregung und Emission des Akzeptors Fluorochrom mRFP und eines Anregungslasers von 561 Nanometern und Emissionsfilter auf 400 bis 597 Nanometer ein.
Stellen Sie den FRET-Kanal für die Anregung des Donors und die Emission der Akzeptorfluorochrome mit einem 405-Nanometer-Anregungslaser und einem 597- bis 617-Nanometer-Emissionsfilter ein. Stellen Sie die Anregungsintensität des Spenders auf ein Mindestniveau ein, um FRET zu beobachten und gleichzeitig Photobleaching zu vermeiden. Anregung des Donors und Suche nach Zellen, die das erwartete Fluoreszenzsignal des Akzeptors enthalten.
Wählen Sie den Bereich aus, der das interessierende Fluoreszenzsignal enthält. Erfassen Sie eine SE-FRET-Bildsequenz, indem Sie die Einrasttaste drücken. Um Parameter für AB-FRET einzurichten, verwenden Sie die für SE-FRET festgelegten Parameter für den Donor- und Akzeptorkanal, deaktivieren Sie jedoch den FRET-Kanal.
Bereiten Sie sich dann darauf vor, die Parameter für das Photobleaching des Akzeptors mRFP einzustellen. Stellen Sie sicher, dass das Bleichen nach fünf Bildern beginnt. Lassen Sie 200 Iterationen für jedes Flächenbleichmittel zu.
Halten Sie 100% Laserintensität bei 561 Nanometern. Halten Sie eine Bleichdauer von 45 Sekunden ein. Stellen Sie eine Scangeschwindigkeit von 512 x 512 Pixeln bei 400 Hertz sicher.
Suchen und zeichnen Sie den Bereich der zu bleichenden Zelle und aktivieren Sie das Bleichen durch Drücken der Schaltfläche Experiment starten. Im Falle der Positivkontrolle beginnt nach fünf Bildern das Bleichen und die Region von Interesse wird grün. Überprüfen Sie den mittleren ROI, um zu bestätigen, dass die Intensität von mRFP abnimmt, während die von GFP zunimmt.
Alternativ können Sie das Layout überprüfen, das zeigt, dass mRFP bleichend war und die GFP zunahm. Um SE-FRET-Daten zu analysieren, verwenden Sie die ImageJ-Software. Öffnen Sie die Bilder und erstellen Sie nur einen Stapel Spender.
Speichern Sie die Bilder in acht Bit als TIF-Datei. Erstellen Sie auf ähnliche Weise den Stapel nur für den Akzeptor und dann einen kombinierten Stapel aus Spender und Akzeptor. Als nächstes verwenden Sie das PixFRET-Plugin, um Bilder der SE-FRET-Effizienz zu generieren.
Öffnen Sie die erstellten Stapel und generieren Sie die korrigierten FRET-Bilder, nachdem Sie den spektralen Durchschnitt subtrahiert haben. Präsentieren Sie das Bild als Pseudofarbbild. Um die AB-FRET-Daten zu analysieren, berechnen Sie den prozentualen AB-FRET als prozentualen Anstieg der GFP-Emission nach mRFP-Photobleiche mit dieser Formel.
Die spezifische Protein-Protein-Interaktion der Histon-Deubiquitinase OTLD1 mit einem Transkriptionsfaktor LSH10 wurde mittels SE-FRET untersucht. Die Zellkerne wurden gleichzeitig in drei Kanälen aufgezeichnet und eine Pseudofarbskala erzeugt, um die SE-FRET-Effizienz darzustellen. Der Übergang von Blau zu Rot entspricht einer Steigerung der FRET-Effizienz und Protein-Protein-Nähe.
Die SE-FRET-Intensität nach der Koexpression von LSH10 und OTLD1 war vergleichbar mit der für die Positivkontrolle mRFP-GFP. Bei Negativkontrollen wie der Koexpression von OTLD1, mRFP und LSH4-GFP oder freiem mRFP und LSH10-GFP wurde kein SE-FRET beobachtet. AB-FRET-Bilder zeigten, dass die Koexpression von LSH10-GFP und OTLD1-mRFP zu einer erhöhten GFP-Donorfluoreszenz führte, nachdem der RFP-Akzeptor photogebleicht wurde.
Ein ähnlicher Anstieg der Donorfluoreszenz wurde bei der Positivkontrolle beobachtet, jedoch nicht bei den Negativkontrollen, wenn die Akzeptorfluoreszenz inaktiviert wurde. Die quantitative Analyse der AB-FRET-Daten zeigte einen statistisch signifikanten Anstieg der Spenderfluoreszenz nach der Koexprimierung von LSH10 und OTLD1. Die Positivkontrolle ergab einen prozentualen AB-FRET von etwa 30%, während die Negativkontrollen keine ergaben.
SE-FRET und AB-FRET zeigten ein Signal im Zellkern, das mit der subzellulären Lokalisation der Transkriptionsfaktor-Histon-modifizierenden Enzymkomplexe sowie der nukleozytoplasmatischen Natur der GFP-MRFP-Proteine übereinstimmt. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, bevor Sie dem Protokoll folgen, ist, je nach konfokalem Nanoskopiemodell das richtige Spenderakzeptor-Express-Paar zu testen. Nach dem Ausführen und Ausführen unserer Iteration dauert es nur 24 bis 36 Stunden, um die Ergebnisse zu erhalten.
Nachdem man sich dieses Video angesehen hat, sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die FRET-Technik verwendet, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen.
