この方法は、タンパク質間相互作用の質問に答えるのに役立ち、生細胞内で互いに10ナノメートル以内に位置する2つのタンパク質を直接検出することができます。この手法の主な利点は、シンプルで再現が簡単なことです。また、多くの近代的な研究所で入手可能な単純な材料も必要です。
この対策は、目的のタンパク質に遷移的に広がる任意の生体組織または培養細胞に使用できます。この手法を初めて使用する場合は、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用して、最初にシステムをテストすることをお勧めします。はじめに、湿った土が密集した鉢にニコチアナベンサミアナの種をまきます。
植えられた種子を摂氏23度に設定された成長室に保管してください。真葉の直径が0.3〜0.5センチメートルに達したら、苗をより大きな鉢に移し、同じパラメータで同じチャンバー内で成長させます。次に、FRETコンストラクトを含む各アグロバクテリウムコロニーを、抗生物質と150マイクロモルのアセトシリンゴンを添加した5ミリリットルのLB培地に接種することにより、アグロ浸潤用の細菌細胞を準備します。
培養液を摂氏28度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、細胞を3, 000 Gで室温で5分間遠心分離します。細胞をアグロイン浸潤バッファーに再懸濁し、OD 600を0.5にします。
二重構築物の農業浸潤の場合、再懸濁した細胞を1対1の体積比で適切な構築物を保持する細胞と結合します。細胞を摂氏28度で30分から1時間インキュベートします。農業浸潤を行うには、細菌培養物を1ミリリットルの無針注射器に入れます。
穏やかに、しかししっかりと、完全に拡張されたニコチアナベンサミアナの葉の腹軸側にシリンジのノズルを押し付け、手袋をはめた指で葉を軸方向に保持します。葉に最大4つのスポット、植物ごとに3つの葉、および細菌培養ごとに2つまたは3つの植物に浸透します。農業浸潤植物を同じ生育室中で、先ほど述べたのと同じ条件下で24〜36時間維持する。
24〜36時間の浸潤後、かみそりの刃を使用して、農業浸潤した各葉を静脈間で2 x 4ミリメートルの小片に切ります。葉片をスライドガラスの上に置き、葉の表面を上に向けて置きます。葉のかけらの上に水滴を置き、カバーガラスで覆います。
カバーガラスを軽くたたいて気泡を取り除きます。次に、顕微鏡とレーザーの電源を入れます。スライドを顕微鏡ステージホルダーに入れます。
SE-FRETのパラメータを設定するには、多次元取得ツールを開きます。次に、ドナー蛍光色素GFPの励起および発光用のドナーチャネルを405ナノメートルの励起レーザーに設定し、発光フィルターを400〜597ナノメートルに設定します。アクセプター蛍光色素mRFPの励起および発光用のアクセプターチャネルと、561ナノメートルの励起レーザーと400〜597ナノメートルの発光フィルターを設定します。
405ナノメートルの励起レーザーと597〜617ナノメートルの発光フィルターを使用して、ドナーの励起とアクセプター蛍光色素の発光用のFRETチャネルを設定します。ドナー励起強度を最小レベルに設定して、光退色を回避しながらFRETを観察します。ドナーを励起し、アクセプターの予想される蛍光シグナルを含む細胞をスキャンします。
目的の蛍光シグナルを含む領域を選択します。スナップボタンを押してSE-FRET画像シーケンスを取得します。AB-FRETのパラメータを設定するには、SE-FRETに設定されたドナーおよびアクセプターチャネルパラメータを使用しますが、FRETチャネルをオフにします。
次に、アクセプターmRFPの光退色のためのパラメータを設定する準備をします。漂白が5枚の画像の後に開始されることを確認してください。各領域ブリーチに対して200回の反復を許可します。
100%レーザー強度を561ナノメートルに保ちます。45秒の漂白時間を維持します。400ヘルツで512 x 512ピクセルのスキャン速度を確保します。
漂白する細胞の領域を検索して描画し、実験開始ボタンを押して漂白を活性化します。ポジティブコントロールの場合、5枚の画像の後、漂白が始まり、関心領域が緑色に変わります。平均ROIをチェックして、mRFPの強度が減少し、GFPの強度が増加していることを確認します。
または、mRFPが漂白され、GFPが増加していることを示すレイアウトを確認します。SE-FRETデータを解析するには、ImageJソフトウェアを使用してください。画像を開き、ドナーのみのスタックを作成します。
画像をTIFファイルとして8ビットで保存します。同様に、アクセプター専用のスタックを作成してから、ドナーとアクセプターを組み合わせたスタックを作成します。次に、PixFRETプラグインを使用して、SE-FRET効率の画像を生成します。
作成したスタックを開き、スペクトルブリードを差し引いた後、補正されたFRET画像を生成します。画像を擬似カラー画像として表示します。AB-FRETデータを解析するには、この式を用いて、mRFP光退色後のGFP放出の増加率としてAB-FRETの割合を計算します。
ヒストンデユビキチナーゼOTLD1と転写因子LSH10との特異的なタンパク質間相互作用をSE-FRETにより研究した。細胞核は3つのチャネルで同時に記録され、SE-FRET効率を表すために擬似カラースケールが生成されました。青から赤への移行は、FRET効率とタンパク質間近接性の増加に対応します。
LSH10とOTLD1の共発現後のSE-FRET強度は、ポジティブコントロールmRFP-GFPについて観察されたものと同等であった。OTLD1、mRFP、およびLSH4-GFPの共発現、または遊離mRFPおよびLSH10-GFPなどの陰性対照では、SE-FRETは観察されなかった。AB-FRET画像は、LSH10-GFPとOTLD1-mRFPの共発現が、RFPアクセプターが光退色した後のGFPドナー蛍光の増加をもたらすことを示した。
ドナー蛍光の同様の増加は、ポジティブコントロールでは観察されたが、アクセプター蛍光が不活性化された場合、ネガティブコントロールでは観察されなかった。AB-FRETデータの定量分析は、LSH10とOTLD1を共発現した後のドナー蛍光の統計的に有意な増加を示しました。陽性対照は約30%のAB-FRETパーセントを生成したが、陰性対照は何も生成しなかった。
SE-FRETおよびAB-FRETは、転写因子ヒストン修飾酵素複合体の細胞内局在およびGFP-MRFPタンパク質の核細胞質的性質と一致する細胞核内のシグナルを示した。プロトコルに従う前に覚えておくべき最も重要なことは、共焦点ナノスコピーモデルに応じて適切なドナーアクセプターエクスプレスペアをテストすることです。実行してイテレーションを実行した後、結果を受け取るのにわずか24〜36時間です。
このビデオを見た後、FRET技術を使用してタンパク質間相互作用を研究する方法をよく理解しているはずです。
