이 방법은 단백질-단백질 상호 작용의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 살아있는 세포 내부에서 서로 10 나노 미터 이내에있는 두 개의 단백질을 직접 검출 할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 재현하기 쉽다는 것입니다. 또한 많은 현대 실험실에서 사용할 수 있는 간단한 재료가 필요합니다.
이 측정은 관심 단백질에서 전이적으로 퍼지는 모든 생체 조직 또는 배양 세포와 함께 사용할 수 있습니다. 이 기술을 처음 사용하는 경우 양성 대조군과 음성 대조군을 사용하여 시스템을 먼저 테스트하는 것이 좋습니다. 시작하려면 니코 티아나 벤타미 아나 씨앗을 젖은 토양이 들어있는 냄비에 고밀도로 뿌립니다.
심은 씨앗을 섭씨 23 도로 설정된 성장 챔버에 보관하십시오. euphyll의 직경이 0.3-0.5 센티미터에 이르면 묘목을 더 큰 화분으로 옮기고 동일한 매개 변수로 동일한 챔버에서 자랄 수 있도록하십시오. 다음으로, FRET 구축물을 포함하는 각 아그로박테리움 콜로니를 항생제와 150 마이크로몰 아세토시링곤이 보충된 5밀리리터의 LB 배지에 접종하여 농업 침윤을 위한 박테리아 세포를 준비합니다.
배양물을 섭씨 28도에서 밤새 배양하십시오. 배양 후, 세포를 실온에서 5분 동안 3, 000 G에서 원심분리한다. 농윤 완충액에 세포를 0.5의 OD 600으로 재현탁시킨다.
이중 구조물 농 침투의 경우, 재현 된 세포를 1 대 1 부피비로 적절한 구조물을 보유하고있는 세포와 결합하십시오. 세포를 섭씨 28도에서 30분 내지 1시간 동안 배양한다. 농업 침투를 수행하려면 박테리아 배양 물을 1 밀리리터 바늘없는 주사기에 넣으십시오.
부드럽지만 단단하게, 완전히 확장 된 Nicotiana benthamiana 잎의 축 방향 쪽에 대해 주사기의 노즐을 누르면서 축 방향 쪽에 장갑을 낀 손가락으로 잎을 잡습니다. 잎에 최대 4 개의 지점, 식물 당 3 개의 잎, 각 박테리아 배양에 대해 2 개 또는 3 개의 식물에 침투합니다. 농윤화 식물을 24 내지 36 시간 동안 앞서 설명한 것과 동일한 조건 하에서 동일한 성장 챔버에 유지한다.
침투 24-36 시간 후, 면도날을 사용하여 각 농작물 침투 잎을 정맥 사이에 2 x 4 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 축 방향 잎 표면이 위를 향하도록 유리 슬라이드에 잎 조각을 놓습니다. 잎 조각에 물 한 방울을 놓고 커버 유리로 덮으십시오.
커버 유리를 살짝 두드려 기포를 제거합니다. 그런 다음 현미경과 레이저를 켭니다. 슬라이드를 현미경 스테이지 홀더에 놓습니다.
SE-FRET에 대한 파라미터를 설정하려면 다차원 수집 도구를 엽니다. 그런 다음 405 나노 미터의 여기 레이저에서 공여체 형광 색소 GFP의 여기 및 방출을위한 도너 채널을 설정하고 400에서 597 나노 미터에서 방출 필터를 설정합니다. 수용체 형광 mRFP 및 561 나노미터의 여기 레이저 및 방출 필터의 여기 및 방출을 위한 수용체 채널을 400 내지 597 나노미터로 설정한다.
405 나노 미터 여기 레이저 및 597-617 나노 미터 방출 필터를 사용하여 공여체의 여기 및 수용체 형광 색소의 방출을위한 FRET 채널을 설정하십시오. 기증자 여기 강도를 최소 수준으로 설정하여 광퇴색을 피하면서 FRET를 관찰하십시오. 공여체를 여기시키고 수용체의 예상되는 형광 신호를 포함하는 세포를 스캔합니다.
관심 있는 형광 신호가 포함된 영역을 선택합니다. 스냅 버튼을 눌러 SE-FRET 이미지 시퀀스를 획득합니다. AB-FRET에 대한 파라미터를 설정하려면 SE-FRET에 설정된 도너 및 억셉터 채널 파라미터를 활용하되 FRET 채널은 끕니다.
그런 다음 수용체 mRFP의 광 표백을위한 매개 변수를 설정할 준비를하십시오. 5개의 이미지 후에 표백이 시작되는지 확인합니다. 각 영역 표백제에 대해 200회 반복을 허용합니다.
100 나노 미터에서 561 % 레이저 강도를 유지하십시오. 표백 지속 시간을 45 초로 유지하십시오. 400Hz에서 512 x 512 픽셀의 스캔 속도를 보장합니다.
표백할 세포의 영역을 검색하여 그리고, 실험 시작 버튼을 눌러 표백을 활성화합니다. 양성 대조군의 경우 5 개의 이미지 후에 표백이 시작되고 관심 영역이 녹색으로 바뀝니다. 평균 ROI를 확인하여 GFP의 강도가 증가하는 동안 mRFP의 강도가 감소하는지 확인합니다.
또는 mRFP가 표백되고 GFP가 증가하고 있음을 보여주는 레이아웃을 확인하십시오. SE-FRET 데이터를 분석하려면 ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오. 이미지를 열고 기증자 만 스택을 만듭니다.
이미지를 8비트 단위로 TIF 파일로 저장합니다. 마찬가지로, 수용체에 대한 스택을 만든 다음 기증자와 수용체의 결합 된 스택을 만듭니다. 다음으로 PixFRET 플러그인을 사용하여 SE-FRET 효율성의 이미지를 생성합니다.
생성된 스택을 열고 스펙트럼 블리드를 뺀 후 수정된 FRET 이미지를 생성합니다. 이미지를 의사 컬러 이미지로 표시합니다. AB-FRET 데이터를 분석하려면 이 공식을 사용하여 mRFP 광퇴색 후 GFP 방출의 백분율 증가로 AB-FRET를 백분율로 계산합니다.
특이적 단백질-히스톤 데우비퀴티나제 OTLD1과 전사 인자 LSH10의 단백질 상호작용을 SE-FRET에 의해 연구하였다. 세포핵을 3개의 채널에서 동시에 기록하고, SE-FRET 효율을 묘사하기 위해 유사색 스케일을 생성하였다. 파란색에서 빨간색으로의 전환은 FRET 효율 및 단백질 - 단백질 근접성의 증가에 해당합니다.
LSH10 및 OTLD1의 동시 발현에 따른 SE-FRET 강도는 양성 대조군 mRFP-GFP에 대해 관찰된 것과 유사하였다. OTLD1, mRFP 및 LSH4-GFP의 동시 발현 또는 유리 mRFP 및 LSH10-GFP와 같은 음성 대조군에서는 SE-FRET가 관찰되지 않았습니다. AB-FRET 이미지는 LSH10-GFP와 OTLD1-mRFP의 동시 발현이 RFP 수용체가 광표백된 후 GFP 공여체 형광이 증가한다는 것을 보여주었습니다.
공여체 형광의 유사한 증가가 양성 대조군에서 관찰되었지만, 수용체 형광이 비활성화되었을 때 음성 대조군에서는 관찰되지 않았다. AB-FRET 데이터의 정량 분석은 LSH10 및 OTLD1을 동시 발현한 후 공여체 형광의 통계적으로 유의한 증가를 입증했습니다. 양성 대조군은 약 30%의 AB-FRET를 생성했지만 음성 대조군은 아무 것도 생성하지 않았습니다.
SE-FRET와 AB-FRET는 GFP-MRFP 단백질의 핵세포질 특성뿐만 아니라 전사 인자 히스톤 변형 효소 복합체의 세포내 국소화와 일치하는 세포핵 내 신호를 보였다. 프로토콜을 따르기 전에 기억해야 할 가장 중요한 것은 컨포칼 나노스코피 모델에 따라 올바른 기증자 수용체 익스프레스 쌍으로 테스트하는 것입니다. 실행하고 반복을 수행 한 후 결과를받는 데 24-36 시간 밖에 걸리지 않습니다.
이 비디오를 본 후에는 FRET 기술을 사용하여 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 방법을 잘 이해해야 합니다.
