Este método puede ayudar a responder las preguntas en la interacción proteína-proteína, nos permitirá detectar directamente dos proteínas ubicadas dentro de 10 nanómetros una de la otra dentro de la célula viva. La principal ventaja de esta técnica es que es simple y fácil de reproducir. También requiere materiales simples que están disponibles en muchos laboratorios modernos.
Esta medida se puede utilizar con cualquier tejido vivo o célula de cultivo que se disemine transicionalmente a la proteína de interés. Si utiliza esta técnica por primera vez, se recomienda que utilice el control positivo y el control negativo para probar el sistema primero. Para comenzar, siembre semillas de Nicotiana benthamiana en una maceta que contenga tierra húmeda a una alta densidad.
Mantenga las semillas plantadas en una cámara de crecimiento establecida a 23 grados centígrados. Cuando el diámetro del euphyll alcance de 0.3 a 0.5 centímetros, transfiera las plántulas a macetas más grandes y permita que crezcan en la misma cámara con los mismos parámetros. A continuación, prepare las células bacterianas para la agroinfiltración inoculando cada colonia de agrobacterias que contiene las construcciones FRET en cinco mililitros de medio LB suplementado con antibióticos y 150 acetotiringona micromolar.
Incubar el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados. Después de la incubación, centrifugar las células a 3, 000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Resuspender las células en tampón de agroinfiltración a un OD 600 de 0.5.
Para la agroinfiltración de doble construcción, combine las células resuspendidas en una proporción de volumen de uno a uno con células que albergan las construcciones apropiadas. Incubar las células a 28 grados centígrados durante 30 minutos a una hora. Para realizar la agroinfiltración, cargue el cultivo bacteriano en una jeringa sin aguja de un mililitro.
Suavemente pero con firmeza, presione la boquilla de la jeringa contra el lado abaxial de las hojas completamente expandidas de Nicotiana benthamiana mientras sostiene la hoja con un dedo enguantado en el lado adaxial. Infiltrar hasta cuatro manchas en una hoja, tres hojas por planta y dos o tres plantas para cada cultivo bacteriano. Mantener las plantas agroinfiltradas en la misma cámara de crecimiento en las mismas condiciones descritas anteriormente durante 24 a 36 horas.
Después de 24 a 36 horas de infiltración, use una cuchilla de afeitar para cortar cada hoja agroinfiltrada en trozos pequeños de dos por cuatro milímetros entre las venas. Coloque las piezas de la hoja en un portaobjetos de vidrio con la superficie de la hoja abaxial hacia arriba. Coloque una gota de agua en los trozos de la hoja y cúbralos con el vidrio de la cubierta.
Golpee ligeramente el vidrio de la cubierta para eliminar las burbujas de aire. Luego encienda el microscopio y el láser. Coloque el portaobjetos en el soporte de la etapa del microscopio.
Para configurar los parámetros de SE-FRET, abra la herramienta de adquisición multidimensional. Luego configure el canal donante para la excitación y emisión del fluorocromo donante GFP a un láser de excitación de 405 nanómetros, y el filtro de emisión a 400 a 597 nanómetros. Ajuste el canal aceptor para excitación y emisión del aceptor fluorocromo mRFP y un láser de excitación de 561 nanómetros y filtro de emisión de 400 a 597 nanómetros.
Ajuste el canal FRET para la excitación del donante y la emisión de los fluorocromos aceptores con un láser de excitación de 405 nanómetros y un filtro de emisión de 597 a 617 nanómetros. Ajuste la intensidad de excitación del donante a un nivel mínimo para observar FRET evitando el fotoblanqueo. Excite al donante y busque células que contengan la señal de fluorescencia esperada del aceptor.
Seleccione la región que contiene la señal de fluorescencia de interés. Adquiera una secuencia de imágenes SE-FRET pulsando el botón de ajuste. Para configurar parámetros para AB-FRET, utilice los parámetros de canal donante y aceptor establecidos para SE-FRET, pero desactive el canal FRET.
A continuación, prepárese para establecer los parámetros para el fotoblanqueo del aceptor mRFP. Asegúrese de que el blanqueamiento comience después de cinco imágenes. Permita 200 iteraciones para cada blanqueador de área.
Mantenga el 100% de intensidad láser a 561 nanómetros. Mantenga una duración de blanqueamiento de 45 segundos. Asegure una velocidad de escaneo de 512 por 512 píxeles a 400 hercios.
Busque y dibuje la región de la celda a blanquear, y active el blanqueamiento presionando el botón iniciar experimento. En caso del control positivo, después de cinco imágenes, comienza el blanqueo y la región de interés se vuelve verde. Verifique el ROI medio para confirmar que la intensidad de mRFP está disminuyendo mientras que la de GFP está aumentando.
Alternativamente, verifique el diseño, que muestra que mRFP se estaba blanqueando y GFP estaba aumentando. Para analizar los datos SE-FRET, utilice el software ImageJ. Abra las imágenes y cree una pila de donantes solamente.
Guarde las imágenes en ocho bits como archivo TIF. Del mismo modo, cree la pila solo para aceptor, luego cree una pila combinada de donante y aceptante. A continuación, utilice el complemento PixFRET para generar imágenes de la eficiencia SE-FRET.
Abra las pilas creadas y genere las imágenes FRET corregidas después de restar el sangrado espectral. Presente la imagen como imagen pseudocolor. Para analizar los datos de AB-FRET, calcule el porcentaje de AB-FRET como el porcentaje de aumento en la emisión de GFP después del fotoblanqueo de mRFP utilizando esta fórmula.
La interacción proteína-proteína específica de la histona desubiquitinasa OTLD1 con un factor de transcripción LSH10 fue estudiada por SE-FRET. Los núcleos celulares se registraron simultáneamente en tres canales, y se generó una escala de pseudocolor para representar la eficiencia SE-FRET. La transición del azul al rojo corresponde a un aumento en la eficiencia FRET y la proximidad proteína-proteína.
La intensidad de SE-FRET después de la coexpresión de LSH10 y OTLD1 fue comparable a la observada para el control positivo mRFP-GFP. No se observó SE-FRET en controles negativos como la coexpresión de OTLD1, mRFP y LSH4-GFP, o mRFP libre y LSH10-GFP. Las imágenes AB-FRET mostraron que la coexpresión de LSH10-GFP y OTLD1-mRFP resultó en un aumento de la fluorescencia del donante de GFP después de que el aceptor de RFP fue fotoblanqueado.
Se observó un aumento similar en la fluorescencia del donante en el control positivo, pero no en los controles negativos cuando se inactivó la fluorescencia aceptora. El análisis cuantitativo de los datos de AB-FRET demostró un aumento estadísticamente significativo en la fluorescencia del donante después de coexpresar LSH10 y OTLD1. El control positivo produjo un porcentaje de AB-FRET de aproximadamente el 30%, mientras que los controles negativos no produjeron ninguno.
SE-FRET y AB-FRET mostraron una señal en el núcleo celular consistente con la localización subcelular de los complejos enzimáticos modificadores de histonas del factor de transcripción, así como la naturaleza nucleocitoplasmática de las proteínas GFP-MRFP. Lo más importante que debe recordar antes de seguir el protocolo es probar en el par expreso aceptor de donante correcto dependiendo del modelo de nanoscopía confocal. Después de ejecutar y hacer nuestra iteración, solo hay de 24 a 36 horas para recibir los resultados.
Después de ver este video, uno debe tener una buena comprensión de cómo usar la técnica FRET para estudiar la interacción proteína-proteína.
