Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande sull'interazione proteina-proteina, ci permetterà di rilevare direttamente due proteine situate entro 10 nanometri l'una dall'altra all'interno della cellula vivente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice e facile da riprodurre. Richiede anche materiali semplici disponibili in molti laboratori moderni.
Questa misura può essere utilizzata con qualsiasi tessuto vivente o cellula di coltura che si diffonde in modo transitorio alla proteina di interesse. Se si utilizza questa tecnica per la prima volta, si consiglia di utilizzare il controllo positivo e il controllo negativo per testare prima il sistema. Per iniziare, semina semi di Nicotiana benthamiana in una pentola contenente terreno umido ad alta densità.
Tenere i semi piantati in una camera di crescita impostata a 23 gradi Celsius. Quando il diametro dell'eufille raggiunge da 0,3 a 0,5 centimetri, trasferire le piantine in vasi più grandi e lasciarle crescere nella stessa camera con gli stessi parametri. Successivamente, preparare le cellule batteriche per l'agroinfiltrazione inoculando ogni colonia di agrobatteri contenente i costrutti FRET in cinque millilitri di mezzo LB integrato con antibiotici e acetosiringone micromolare 150.
Incubare la cultura durante la notte a 28 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 3.000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in tampone di agroinfiltrazione a un OD 600 di 0,5.
Per l'agroinfiltrazione a doppio costrutto, combinare le celle risospese con un rapporto di volume uno a uno con celle che ospitano i costrutti appropriati. Incubare le cellule a 28 gradi Celsius per 30 minuti a un'ora. Per eseguire l'agroinfiltrazione, caricare la coltura batterica in una siringa senza ago da un millilitro.
Delicatamente ma con fermezza, premere l'ugello della siringa contro il lato abassiale delle foglie di Nicotiana benthamiana completamente espanse tenendo la foglia con un dito guantato sul lato adassiale. Infiltrarsi fino a quattro punti su una foglia, tre foglie per pianta e due o tre piante per ogni coltura batterica. Mantenere le piante agroinfiltrate nella stessa camera di crescita nelle stesse condizioni descritte in precedenza per 24-36 ore.
Dopo 24-36 ore di infiltrazione, utilizzare una lama di rasoio per tagliare ogni foglia agroinfiltrata in piccoli pezzi di due per quattro millimetri tra le vene. Posizionare i pezzi di foglia su un vetrino con la superficie della foglia abassiale rivolta verso l'alto. Metti una goccia d'acqua sui pezzi di foglie e coprili con il vetro di copertura.
Picchiettare leggermente il vetro di copertura per rimuovere le bolle d'aria. Quindi accendere il microscopio e il laser. Posizionare il vetrino nel supporto del palco del microscopio.
Per impostare i parametri per SE-FRET, aprite lo strumento di acquisizione multidimensionale. Quindi impostare il canale donatore per l'eccitazione e l'emissione della GFP fluorocromica del donatore su un laser di eccitazione di 405 nanometri e il filtro di emissione su 400-597 nanometri. Impostare il canale accettore per l'eccitazione e l'emissione dell'accettore fluorocromo mRFP e un laser di eccitazione di 561 nanometri e filtro di emissione da 400 a 597 nanometri.
Impostare il canale FRET per l'eccitazione del donatore e l'emissione dei fluorocromi accettori con un laser di eccitazione da 405 nanometri e un filtro di emissione da 597 a 617 nanometri. Impostare l'intensità di eccitazione del donatore a un livello minimo per osservare FRET evitando il fotosbiancamento. Eccitare il donatore ed eseguire la scansione per le cellule contenenti il segnale di fluorescenza atteso dell'accettore.
Selezionare la regione che contiene il segnale di fluorescenza di interesse. Acquisire una sequenza di immagini SE-FRET premendo il pulsante a scatto. Per impostare i parametri per AB-FRET, utilizzare i parametri del canale donatore e accettore impostati per SE-FRET, ma disattivare il canale FRET.
Quindi preparare a impostare i parametri per il fotosbiancamento dell'accettore mRFP. Assicurati che lo sbiancamento inizi dopo cinque immagini. Consentire 200 iterazioni per ogni area candeggina.
Mantieni l'intensità laser al 100% a 561 nanometri. Mantenere una durata dello sbiancamento di 45 secondi. Garantire una velocità di scansione di 512x512 pixel a 400 hertz.
Cerca e disegna la regione della cella da sbiancare e attiva lo sbiancamento premendo il pulsante di avvio dell'esperimento. In caso di controllo positivo, dopo cinque immagini, inizia lo sbiancamento e la regione di interesse diventa verde. Controlla il ROI medio per confermare che l'intensità di mRFP sta diminuendo mentre quella di GFP è in aumento.
In alternativa, controlla il layout, che mostra che mRFP stava sbiancando e GFP stava aumentando. Per analizzare i dati SE-FRET, utilizzare il software ImageJ. Apri le immagini e crea una pila di soli donatori.
Salva le immagini in otto bit come file TIF. Allo stesso modo, creare lo stack solo per accettore, quindi creare uno stack combinato di donatore e accettore. Successivamente, utilizzare il plug-in PixFRET per generare immagini dell'efficienza SE-FRET.
Aprire le pile create e generare le immagini FRET corrette dopo aver sottratto la pagina al vivo spettrale. Presentare l'immagine come immagine pseudocolore. Per analizzare i dati AB-FRET, calcolare la percentuale AB-FRET come aumento percentuale delle emissioni di GFP dopo il fotosbiancamento mRFP utilizzando questa formula.
L'interazione specifica proteina-proteina dell'istone deubiquitinasi OTLD1 con un fattore di trascrizione LSH10 è stata studiata da SE-FRET. I nuclei cellulari sono stati registrati simultaneamente in tre canali ed è stata generata una scala di pseudocolori per rappresentare l'efficienza SE-FRET. Il passaggio dal blu al rosso corrisponde ad un aumento dell'efficienza FRET e della vicinanza proteina-proteina.
L'intensità di SE-FRET dopo la co-espressione di LSH10 e OTLD1 è stata paragonabile a quella osservata per il controllo positivo mRFP-GFP. Nessun SE-FRET è stato osservato in controlli negativi come la co-espressione di OTLD1, mRFP e LSH4-GFP, o mRFP libera e LSH10-GFP. Le immagini AB-FRET hanno mostrato che la co-espressione di LSH10-GFP e OTLD1-mRFP ha determinato un aumento della fluorescenza del donatore GFP dopo che l'accettore RFP è stato fotosbiancato.
Un simile aumento della fluorescenza del donatore è stato osservato nel controllo positivo, ma non nei controlli negativi quando la fluorescenza accettore è stata inattivata. L'analisi quantitativa dei dati AB-FRET ha dimostrato un aumento statisticamente significativo della fluorescenza del donatore dopo aver coespresso LSH10 e OTLD1. Il controllo positivo ha prodotto una percentuale AB-FRET di circa il 30%, mentre i controlli negativi non ne hanno prodotto nessuno.
SE-FRET e AB-FRET hanno mostrato un segnale nel nucleo cellulare coerente con la localizzazione subcellulare dei complessi enzimatici modificanti gli istoni del fattore di trascrizione e con la natura nucleocitoplasmatica delle proteine GFP-MRFP. La cosa più importante da ricordare prima di seguire il protocollo è testare la giusta coppia di accettori espressi del donatore a seconda del modello di nanoscopia confocale. Dopo aver eseguito ed eseguito la nostra iterazione, sono solo 24-36 ore per ricevere i risultati.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnica FRET per studiare l'interazione proteina-proteina.
