Cette méthode peut aider à répondre aux questions sur l’interaction protéine-protéine, nous permettra de détecter directement deux protéines situées à moins de 10 nanomètres l’une de l’autre à l’intérieur de la cellule vivante. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et facile à reproduire. Cela nécessite également des matériaux simples disponibles dans de nombreux laboratoires modernes.
Cette mesure peut être utilisée avec n’importe quel tissu vivant ou cellule de culture qui se propage de manière transitoire à la protéine d’intérêt. Si vous utilisez cette technique pour la première fois, il est recommandé d’utiliser d’abord le contrôle positif et le contrôle négatif pour tester le système. Pour commencer, semez les graines de Nicotiana benthamiana dans un pot contenant un sol humide à haute densité.
Conservez les graines plantées dans une chambre de croissance réglée à 23 degrés Celsius. Lorsque le diamètre de l’euphylle atteint 0,3 à 0,5 centimètre, transférez les plants dans des pots plus grands et laissez-les pousser dans la même chambre avec les mêmes paramètres. Ensuite, préparez les cellules bactériennes pour l’agroinfiltration en inoculant chaque colonie d’agrobactéries contenant les constructions FRET dans cinq millilitres de milieu LB complété par des antibiotiques et 150 acétosyringones micromolaires.
Incuber la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Après incubation, centrifuger les cellules à 3 000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans un tampon d’agroinfiltration à une DO 600 de 0,5.
Pour l’agro-infiltration à double construction, combinez les cellules en suspension à un rapport de volume de un pour un avec des cellules hébergeant les constructions appropriées. Incuber les cellules à 28 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure. Pour effectuer l’agroinfiltration, chargez la culture bactérienne dans une seringue sans aiguille d’un millilitre.
Doucement mais fermement, pressez la buse de la seringue contre la face abaxiale des feuilles de Nicotiana benthamiana complètement élargies tout en tenant la feuille avec un doigt ganté sur la face adaxiale. Infiltrer jusqu’à quatre taches sur une feuille, trois feuilles par plante et deux ou trois plantes pour chaque culture bactérienne. Maintenir les plantes agroinfiltrées dans la même chambre de croissance dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment pendant 24 à 36 heures.
Après 24 à 36 heures d’infiltration, utilisez une lame de rasoir pour couper chaque feuille agroinfiltrée en petits morceaux de deux millimètres sur quatre entre les nervures. Placez les morceaux de feuilles sur une lame de verre avec la surface de la feuille abaxiale tournée vers le haut. Placez une goutte d’eau sur les morceaux de feuilles et couvrez-les avec le verre de couverture.
Tapotez légèrement le verre du couvercle pour éliminer les bulles d’air. Ensuite, allumez le microscope et le laser. Placez la lame dans le porte-platine du microscope.
Pour configurer les paramètres de SE-FRET, ouvrez l’outil d’acquisition multidimensionnelle. Réglez ensuite le canal donneur pour l’excitation et l’émission du fluorochrome donneur GFP sur un laser d’excitation de 405 nanomètres et le filtre d’émission sur 400 à 597 nanomètres. Régler le canal accepteur pour l’excitation et l’émission de l’accepteur fluorochrome mRFP et un laser d’excitation de 561 nanomètres et filtre d’émission à 400 à 597 nanomètres.
Réglez le canal FRET pour l’excitation du donneur et l’émission des fluorochromes accepteurs avec un laser d’excitation de 405 nanomètres et un filtre d’émission de 597 à 617 nanomètres. Réglez l’intensité d’excitation du donneur à un niveau minimum pour observer FRET tout en évitant le photoblanchiment. Exciter le donneur et rechercher des cellules contenant le signal de fluorescence attendu de l’accepteur.
Sélectionnez la région qui contient le signal de fluorescence d’intérêt. Acquérir une séquence d’images SE-FRET en appuyant sur le bouton d’accrochage. Pour configurer des paramètres pour AB-FRET, utilisez les paramètres de canal donneur et accepteur définis pour SE-FRET, mais désactivez le canal FRET.
Préparez-vous ensuite à définir les paramètres de photoblanchiment de l’accepteur mRFP. Assurez-vous que le blanchiment commence après cinq images. Permettre 200 itérations pour chaque zone d’eau de Javel.
Maintenez une intensité laser de 100% à 561 nanomètres. Maintenez une durée de blanchiment de 45 secondes. Assurez une vitesse de numérisation de 512 x 512 pixels à 400 hertz.
Recherchez et dessinez la région de la cellule à blanchir, et activez le blanchiment en appuyant sur le bouton de démarrage de l’expérience. Dans le cas du contrôle positif, après cinq images, le blanchiment commence et la région d’intérêt devient verte. Vérifiez le retour sur investissement moyen pour confirmer que l’intensité de mRFP diminue alors que celle de la GFP augmente.
Vous pouvez également vérifier la mise en page, qui montre que mRFP blanchissait et que la GFP augmentait. Pour analyser les données SE-FRET, utilisez le logiciel ImageJ. Ouvrez les images et créez une pile de donneurs uniquement.
Enregistrez les images en huit bits en tant que fichier TIF. De même, créez la pile pour l’accepteur uniquement, puis créez une pile combinée de donneur et d’accepteur. Ensuite, utilisez le plugin PixFRET pour générer des images de l’efficacité SE-FRET.
Ouvrez les piles créées et générez les images FRET corrigées après avoir soustrait le fond spectral. Présentez l’image en tant qu’image pseudo-couleur. Pour analyser les données AB-FRET, calculez le pourcentage AB-FRET comme le pourcentage d’augmentation des émissions de GFP après photoblanchiment mRFP à l’aide de cette formule.
L’interaction protéine-protéine spécifique de l’histone déubiquitinase OTLD1 avec un facteur de transcription LSH10 a été étudiée par SE-FRET. Les noyaux cellulaires ont été enregistrés simultanément dans trois canaux, et une échelle de pseudo-couleur a été générée pour décrire l’efficacité SE-FRET. Le passage du bleu au rouge correspond à une augmentation de l’efficacité du FRET et de la proximité protéine-protéine.
L’intensité SE-FRET après la co-expression de LSH10 et OTLD1 était comparable à celle observée pour le contrôle positif mRFP-GFP. Aucun SE-FRET n’a été observé chez les témoins négatifs tels que la co-expression d’OTLD1, mRFP et LSH4-GFP, ou mRFP libre et LSH10-GFP. Les images AB-FRET ont montré que la co-expression de LSH10-GFP et OTLD1-mRFP entraînait une augmentation de la fluorescence du donneur GFP après photoblanchiment de l’accepteur RFP.
Une augmentation similaire de la fluorescence du donneur a été observée chez le témoin positif, mais pas chez les témoins négatifs lorsque la fluorescence de l’accepteur était inactivée. L’analyse quantitative des données AB-FRET a démontré une augmentation statistiquement significative de la fluorescence du donneur après coexpression de LSH10 et OTLD1. Le contrôle positif a produit un pourcentage AB-FRET d’environ 30%, tandis que les témoins négatifs n’en ont produit aucun.
SE-FRET et AB-FRET ont montré un signal dans le noyau cellulaire compatible avec la localisation subcellulaire des complexes enzymatiques modifiant les histones du facteur de transcription ainsi que la nature nucléocytoplasmique des protéines GFP-MRFP. La chose la plus importante à retenir avant de suivre le protocole est de tester la bonne paire d’accepteurs de donneurs express en fonction du modèle de nanoscopie confocale. Après avoir exécuté et fait notre itération, il ne reste que 24 à 36 heures pour recevoir les résultats.
Après avoir regardé cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la technique FRET pour étudier l’interaction protéine-protéine.
