这种方法可以帮助回答蛋白质与蛋白质相互作用中的问题，将使我们能够直接检测活细胞内彼此相距10纳米以内的两种蛋白质。这种技术的主要优点是简单易复制。它还需要许多现代实验室提供的简单材料。
该测量可用于在目标蛋白质上过渡扩散的任何活组织或培养细胞。如果您是第一次使用此技术，建议您先使用阳性对照和阴性对照来测试系统。首先，将本氏烟草种子播种在含有高密度湿土壤的盆中。
将种植的种子保存在23摄氏度的生长室中。当叶肉的直径达到0.3至0.5厘米时，将幼苗转移到较大的花盆中，并让它们在具有相同参数的同一腔室中生长。接下来，通过将含有FRET构建物的每个农杆菌菌落接种在补充有抗生素和150微摩尔乙酰丁香酮的5毫升LB培养基中，制备用于农业浸润的细菌细胞。
将培养物在28摄氏度下孵育过夜。孵育后，在室温下以3， 000G离心细胞5分钟。将细胞重悬于农业浸润缓冲液中至OD 600为0.5。
对于双构建体农业渗透，以一比一的体积比将重悬的细胞与具有适当构建体的细胞组合。将细胞在28摄氏度下孵育30分钟至1小时。要进行农业渗透，请将细菌培养物装入一毫升无针注射器中。
轻轻但坚定地将注射器的喷嘴压在完全膨胀的本氏烟草叶的远轴侧，同时用戴手套的手指在近轴侧握住叶子。浸润一片叶子上最多四个斑点，每株植物三片叶子，每种细菌培养物浸润两到三株。在与前面描述的相同条件下将农业渗透的植物保持在相同的生长室中 24 至 36 小时。
浸润 24 至 36 小时后，使用剃须刀片将每片农渗叶子切成静脉之间两乘四毫米的小块。将叶片放在载玻片上，叶子的远轴表面朝上。将一滴水放在叶片上，并用盖玻片覆盖它们。
轻轻敲击盖板玻璃以去除气泡。然后打开显微镜和激光。将载玻片放入显微镜载物台支架中。
要设置 SE-FRET，请打开多维采集工具。然后设置供体通道，用于在405纳米的激发激光下激发和发射供体荧光染料GFP，并在400至597纳米处设置发射滤光片。设置受体通道，用于激发和发射受体荧光染料mRFP和561纳米的激发激光和400至597纳米的发射滤光片。
设置FRET通道，用于激发供体并使用405纳米激发激光器和发射受体荧光染料，并使用597至617纳米发射滤光片。将供体激发强度设置为最低水平，以观察FRET，同时避免光漂白。激发供体并扫描含有受体预期荧光信号的细胞。
选择包含感兴趣的荧光信号的区域。通过按捕捉按钮获取SE-FRET图像序列。要设置 AB-FRET 的参数，请使用为 SE-FRET 设置的供体和受体通道参数，但关闭 FRET 通道。
然后准备设置受体mRFP的光漂白参数。确保在五个图像后开始漂白。每个区域漂白剂允许 200 次迭代。
将 100% 激光强度保持在 561 纳米。保持 45 秒的漂白时间。确保 400 赫兹的扫描速度为 512 x 512 像素。
搜索并绘制要漂白的细胞区域，并通过按开始实验按钮激活漂白。在阳性对照的情况下，在五张图像后，漂白开始，感兴趣区域变为绿色。检查平均投资回报率以确认 mRFP 的强度在降低，而 GFP 的强度在增加。
或者，检查布局，显示 mRFP 正在漂白，GFP 正在增加。要分析 SE-FRET 数据，请使用 ImageJ 软件。打开图像并仅创建一堆捐赠者。
将图像保存为八位为TIF文件。同样，仅为受体创建堆栈，然后创建供体和受体的组合堆栈。接下来，使用 PixFRET 插件生成 SE-FRET 效率的图像。
打开创建的堆栈，并在减去光谱出血后生成校正后的FRET图像。将图像显示为伪彩色图像。要分析 AB-FRET 数据，请使用此公式将 AB-FRET 百分比计算为 mRFP 光漂白后 GFP 发射增加的百分比。
通过SE-FRET研究了组蛋白去泛素酶OTLD1与转录因子LSH10的特异性蛋白质 - 蛋白质相互作用。将细胞核同时记录在三个通道中，并生成伪色标度以描述SE-FRET效率。从蓝色到红色的转变对应于FRET效率和蛋白质 - 蛋白质接近度的增加。
LSH10和OTLD1共表达后的SE-FRET强度与阳性对照mRFP-GFP观察到的强度相当。在阴性对照中未观察到SE-FRET，例如OTLD1，mRFP和LSH4-GFP的共表达，或游离mRFP和LSH10-GFP。AB-FRET图像显示，LSH10-GFP和OTLD1-mRFP的共表达导致RFP受体光漂白后GFP供体荧光增加。
在阳性对照中观察到类似的供体荧光增加，但在受体荧光失活时在阴性对照中没有。AB-FRET数据的定量分析表明，共表达LSH10和OTLD1后，供体荧光在统计学上显着增加。阳性对照产生约30%的AB-FRET百分比，而阴性对照则不产生。
SE-FRET和AB-FRET在细胞核中显示出与转录因子组蛋白修饰酶复合物的亚细胞定位以及GFP-MRFP蛋白的核细胞质性质一致的信号。在遵循协议之前要记住的最重要的事情是根据共聚焦纳米模型测试正确的供体受体表达对。运行并执行迭代后，只需 24 到 36 小时即可收到结果。
观看此视频后，应该对如何使用FRET技术研究蛋白质 - 蛋白质相互作用有很好的了解。
