שיטה זו יכולה לעזור לענות על השאלות באינטראקציה בין חלבון לחלבון, תאפשר לנו לזהות ישירות שני חלבונים הממוקמים במרחק של 10 ננומטר זה מזה בתוך תא חי. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי זה פשוט וקל להתרבות. זה גם דורש חומרים פשוטים הזמינים במעבדות מודרניות רבות.
ניתן להשתמש במדד זה עם כל רקמה חיה או תא תרבית המתפשטים במעבר בחלבון בעל עניין. אם אתה משתמש בטכניקה זו בפעם הראשונה, מומלץ להשתמש בבקרה החיובית ובבקרה השלילית כדי לבדוק תחילה את המערכת. כדי להתחיל, לזרוע זרעי Nicotiana benthamiana בסיר המכיל אדמה רטובה בצפיפות גבוהה.
שמור את הזרעים הנטועים בתא גידול שנקבע על 23 מעלות צלזיוס. כאשר קוטר האופיל מגיע ל -0.3 עד 0.5 סנטימטרים, מעבירים את השתילים לעציצים גדולים יותר ומאפשרים להם לגדול באותו תא עם אותם פרמטרים. לאחר מכן, הכינו תאי חיידקים לחדירת אגרואינפורמציה על ידי חיסון כל מושבת אגרובקטריום המכילה את מבני FRET בחמישה מיליליטרים של מדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה ו-150 מיקרומולר אצטו-סירינגון.
לדגור על התרבות למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, צנטריפוגה של התאים ב 3, 000 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השהה את התאים במאגר חדירת אגרואינפורמציה ל- OD 600 של 0.5.
עבור חדירת אגרואינפורמציה כפולה, שלב את התאים המחודשים ביחס נפח של אחד לאחד עם תאים בעלי המבנים המתאימים. לדגור על התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד שעה. כדי לבצע אגרואינפיציה, לטעון את תרבית החיידקים לתוך מזרק אחד מיליליטר ללא מחט.
בעדינות אך בחוזקה, לחץ את הזרבובית של המזרק כנגד הצד האבקסיאלי של עלי הניקוטיאנה המורחבים במלואם תוך החזקת העלה עם אצבע עם כפפות בצד האדאקסיאלי. מסתננים עד ארבעה כתמים על עלה, שלושה עלים לכל צמח, ושניים או שלושה צמחים לכל תרבית חיידקים. שמור על הצמחים האגרו-חדורים באותו תא גידול באותם תנאים כפי שתואר קודם לכן במשך 24 עד 36 שעות.
לאחר 24 עד 36 שעות של חדירה, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך כל עלה אגרו-חדור לחתיכות קטנות של שניים על ארבעה מילימטרים בין הוורידים. הניחו את חתיכות העלים על מגלשת זכוכית כשמשטח העלה האבקסיאלי פונה כלפי מעלה. מניחים טיפת מים על חתיכות העלים, ומכסים אותם בכוס הכיסוי.
הקישו קלות על הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן הפעל את המיקרוסקופ והלייזר. הכניסו את המגלשה לתוך מחזיק הבמה של המיקרוסקופ.
כדי להגדיר את הפרמטרים עבור SE-FRET, פתח את כלי הרכישה הרב-ממדי. לאחר מכן הגדר את ערוץ התורם לעירור ופליטה של התורם פלואורוכרום GFP בלייזר עירור של 405 ננומטר, ומסנן פליטה ב 400 עד 597 ננומטר. הגדר את תעלת המקבל לעירור ופליטה של המקבל fluorochrome mRFP ולייזר עירור של 561 ננומטר ומסנן פליטה ב 400 עד 597 ננומטר.
הגדר את ערוץ FRET לעירור התורם והפליטה של הפלואורוכרומים המקבלים באמצעות לייזר עירור של 405 ננומטר ומסנן פליטה של 597 עד 617 ננומטר. הגדר את עוצמת העירור של התורם ברמה מינימלית כדי לצפות ב- FRET תוך הימנעות מהלבנת תמונות. להלהיב את התורם ולסרוק אחר תאים המכילים את האות הפלואורסצנטי הצפוי של המקבל.
בחר את האזור המכיל את אות העניין הפלואורסצנטי. רכוש רצף תמונות SE-FRET על-ידי לחיצה על לחצן ההצמדה. כדי להגדיר פרמטרים עבור AB-FRET, השתמש בפרמטרים של ערוץ התורם והמקבל שהוגדרו עבור SE-FRET, אך כבה את ערוץ FRET.
לאחר מכן התכוננו להגדיר את הפרמטרים להלבנת תמונות של mRFP המקבל. ודאו שההלבנה מתחילה אחרי חמש תמונות. אפשר 200 איטרציות לכל אזור אקונומיקה.
שמור על עוצמת לייזר של 100% ב-561 ננומטר. שמרו על משך הלבנה של 45 שניות. הבטח מהירות סריקה של 512 על 512 פיקסלים ב- 400 הרץ.
חפש וצייר את אזור התא שיש להלבין, והפעל את ההלבנה על-ידי לחיצה על לחצן התחל ניסוי. במקרה של שליטה חיובית, לאחר חמש תמונות, הלבנה מתחילה, ואת האזור של עניין הופך ירוק. בדוק החזר השקעה ממוצע כדי לאשר שעוצמת ה- mRFP יורדת בעוד זו של GFP גדלה.
לחלופין, בדוק את הפריסה, אשר מראה כי mRFP היה הלבנה ו GFP גדל. כדי לנתח נתוני SE-FRET, השתמש בתוכנת ImageJ. פתחו את התמונות וצרו ערימה של תורמים בלבד.
שמור את התמונות בשמונה סיביות כקובץ TIF. באופן דומה, צור את המחסנית עבור מקבל בלבד, ולאחר מכן צור ערימה משולבת של תורם ומקבל. לאחר מכן, השתמש בתוסף PixFRET כדי ליצור תמונות של יעילות SE-FRET.
פתחו את הערימות שנוצרו, וצרו את תמונות FRET המתוקנות לאחר הפחתת הבליד הספקטרלי. הצג את התמונה כתמונה פסאודו-צבעונית. כדי לנתח את נתוני AB-FRET, חשב את אחוז AB-FRET כעלייה באחוזים בפליטת GFP לאחר הלבנת תמונות mRFP באמצעות נוסחה זו.
אינטראקציה ספציפית בין חלבון לחלבון של היסטון דוביקוויטינאז OTLD1 עם גורם שעתוק LSH10 נחקרה על ידי SE-FRET. גרעיני התאים תועדו בו זמנית בשלושה ערוצים, ונוצר סולם פסאודו-צבעוני כדי לתאר את יעילות SE-FRET. המעבר מכחול לאדום מתאים לעלייה ביעילות FRET ובקרבת חלבון-חלבון.
עוצמת SE-FRET בעקבות הביטוי המשותף של LSH10 ו- OTLD1 הייתה דומה לזו שנצפתה עבור הבקרה החיובית mRFP-GFP. לא נצפה SE-FRET בבקרות שליליות כגון ביטוי משותף של OTLD1, mRFP ו- LSH4-GFP, או mRFP חופשי ו- LSH10-GFP. תמונות AB-FRET הראו כי הביטוי המשותף של LSH10-GFP ו- OTLD1-mRFP הביא לפלואורסצנטיות מוגברת של תורם GFP לאחר שמקבל ה- RFP עבר פוטו-אקונומיקה.
עלייה דומה בפלואורסצנציה של התורם נצפתה בבקרה החיובית, אך לא בבקרות השליליות כאשר הפלואורסצנציה המקבלת הושתקה. ניתוח כמותי של נתוני AB-FRET הראה עלייה מובהקת סטטיסטית בפלואורסצנטיות התורמים לאחר שיתוף פעולה של LSH10 ו- OTLD1. הבקרה החיובית הניבה אחוז AB-FRET של כ-30% ואילו הבקרות השליליות לא הניבו אף אחד.
SE-FRET ו-AB-FRET הראו אות בגרעין התא התואם את הלוקליזציה התת-תאית של גורמי השעתוק של קומפלקסים של אנזימים המשנים את הגוף, כמו גם את האופי הנוקלאוציטופלסמי של חלבוני GFP-MRFP. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור לפני ביצוע הפרוטוקול הוא לבדוק את זוג האקספרס המקבל הנכון בהתאם למודל הננוסקופיה הקונפוקלית. לאחר ריצה וביצוע האיטרציה שלנו, זה רק 24 עד 36 שעות כדי לקבל את התוצאות.
לאחר צפייה בסרטון זה, יש להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקת FRET כדי לחקור אינטראקציה בין חלבון לחלבון.
