Este protocolo descreve um método otimizado de quimioluminescência baseado em L-012 para detectar a produção de ROS em tempo real após a elicitação de PAMP em tecidos de arroz. Este método é fácil, padronizado e altamente reprodutível sob condições firmemente controladas. Quem demonstrará esse procedimento será On Ying, estudante de doutorado do meu laboratório.
Para começar, esterilize as sementes de arroz descascadas com etanol 70% por um minuto e, em seguida, com hipoclorito de sódio a 40% por uma hora. Enxágue as sementes cinco vezes com água estéril para remover o cloro residual. No método da bainha de arroz, plaquear diretamente as sementes no recipiente de vidro estéril com meio Murashige e Skoog ou MS.
Para plaquear as sementes pelo método do disco foliar, plaqueie-as em placas MS por cinco a sete dias e, em seguida, transplante-as para a matriz de crescimento ou solo. Cultivar as mudas em uma sala de crescimento com um período de fotos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Cortar a bainha de mudas de arroz com 10 dias de idade em segmentos de três milímetros com lâmina de barbear afiada ou lâmina cirúrgica para pré-tratamento um dia antes do ensaio de ROS.
Coloque cinco segmentos de bainha em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas. Corte os discos foliares de plantas de arroz de quatro a seis semanas usando um punch de biópsia com um êmbolo. Sempre corte os discos foliares a partir do terço médio da segunda folha do perfilhador principal para reduzir a variação dos dados.
Em seguida, colocar um disco foliar em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas para pré-tratamento. Mantenha todos os discos foliares flutuando e virados para cima nos poços de uma placa de microtitulação para pré-tratamento de água para evitar variação associada ao lado da folha. Prepare a solução de elicitação combinando 9,4 mililitros de 50 micromolares Tris Hcl, 400 microlitros de solução L012, 100 microlitros de peroxidase de rabanete de cavalo e 100 microlitros de Flg22.
Adicionar 200 microlitros de solução de elicitação aos poços. Inicie o software e clique no botão de experimentos para criar um novo protocolo ou usar um protocolo existente. Clique no procedimento no pop-up para configurar a placa e selecionar os poços da placa a serem monitorados.
Clique em iniciar cinética e defina o tempo de execução para 30 minutos ou mais, dependendo dos requisitos experimentais. Selecione o intervalo mínimo para obter as leituras com a maior frequência possível. E para o tempo de integração, escolha um segundo ou mais, dependendo da intensidade do sinal.
Clique em validar, seguido de Ok para confirmar as configurações, em seguida, clique em detectar a nova placa no pop-up e aguarde até que o software avise a caixa de diálogo da placa de carga. Remova cuidadosamente a água bidestilada dos poços que contêm os tecidos pré-tratados, evitando qualquer dano tecidual ou dessecação. Use uma pipeta multicanal para adicionar 200 microlitros da solução de elicitação aos poços contendo os tecidos.
Coloque a placa a ser testada no suporte e inicie a detecção. Para a indução de ERO por Flg22, foram utilizados discos foliares e bainhas de três milímetros de comprimento. A geração de ROS é monitorada por 35 minutos.
As barras indicam as médias dos desvios-padrão calculados a partir de cinco repetições técnicas. No arroz, o aumento na produção de ERO foi detectado pela primeira vez em um a dois minutos, atingiu o pico em 10 a 12 minutos e retornou à linha de base em cerca de 30 a 35 minutos. A quantidade total de ROS foi calculada a partir da curva.
Para obter a quantidade total de valores de ROS, aplique a fórmula aos conjuntos de dados correspondentes para calcular o ROS gerado em cada intervalo de tempo, que pode ser combinado aplicando a soma da fórmula para calcular a quantidade total gerada. Um único orifício ou duas metades de um disco foliar foram colocados nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços pré-tratada com 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas e, em seguida, tratada com Flg22 para indução de EROs. Os valores de leitura das duas amostras de meio disco são muito maiores do que os do disco de folha inteira.
Em média, os valores totais das duas amostras de meio disco são quase 1,6 vezes maiores do que os do disco foliar inteiro, o que é proporcional ao comprimento da borda, não à área das amostras. Esse resultado confirma que as ERO são geradas principalmente nas células do local da ferida. Ao tentar com este procedimento, opere com os tecidos suavemente e não faça cortes extras que poderiam ser uma fonte de variação de dados.
Este método pode ser aplicado a qualquer outro processo fisiológico produtor de ERO em tecidos vegetais.
