Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии

Резюме

3-D структура молекулы дает уникальное понимание того, как функции молекулы. Основным методом определения структуры в ближнем атомное разрешение рентгеновской кристаллографии. Здесь мы демонстрируем, современные методы получения трехмерных кристаллов любой макромолекулы, которые подходят для определения структуры методом рентгеновской кристаллографии.

Аннотация

Использование трехмерной структуры биологических макромолекул сделать вывод, как они функционируют является одним из важнейших направлений современной биологии. Наличие атомных структур разрешение обеспечивает глубокое и уникальное понимание функции белка, и помогает раскрыть внутренние механизмы живой клетки. На сегодняшний день 86% Protein Data Bank (rcsb-PDB) записи макромолекулярных структур, которые были определены с помощью рентгеновской кристаллографии.

Для получения кристаллов подходит для кристаллографических исследований, макромолекулы (например, белки, нуклеиновые кислоты, белок-белкового комплекса или белково-нуклеиновых кислот комплекса) должны быть очищены до гомогенного состояния, или как можно ближе к однородности. Однородности подготовки является ключевым фактором в получении кристаллы, которые преломляют с высоким разрешением (Bergfors, 1999; Макферсон, 1999).

Кристаллизация требует приведения макромолекулы пересыщения. Выборка должна быть сосредоточена в максимально возможной концентрации, не вызывая агрегации или осаждения макромолекулы (обычно 2-50 мг / мл). Введение образца осадителя может способствовать зарождению кристаллов белка в решение, которое может привести к большим трехмерным выращивания кристаллов из раствора. Есть два основных метода получения кристаллов: диффузии пара и пакетного кристаллизации. В диффузии водяного пара, капли, содержащие смесь осадителя и белковых растворов запечатывается в камере с чистой осадителя. Водяной пар затем диффундирует из падают осмолярность падение и осадителя равны (рис. 1А). Обезвоживания падение причины медленного концентрации белка и осадителя, пока равновесие достигается, в идеале в кристалле зоне зарождения фазовой диаграммы. Партия метод основан на ввоз белок непосредственно в зоне зарождения, смешивая белки с соответствующим количеством осадителя (рис. 1В). Этот метод обычно проводится под парафином / смесь минерального масла, чтобы предотвратить распространение воды из капли.

Здесь мы покажем два вида экспериментальной установки для диффузии пара, висячей капли и, сидя капли, в дополнение к партии кристаллизации в масле.

протокол

Материалы по теме:

• Белки образца - лизоцима (50 мг / мл)
• Висячие падение 24-а лоток
• Сидя падение 24-а лоток
• Microbatch кристаллизации 96 и лоток
• Кристаллизация решений (как коммерческих, в наличии или домашний)
• Силиконовая смазка
• 5 мл шприц без Луер-Лок
• Силиконизированный слайды крышкой
• Оптический уплотнительная лента
• Парафин
• 0.1-2 мкл микропипетки с низким уровнем удержания советы
• Пинцет
• Профессиональные салфетки

1. Висячие / сидя удалить процедуру:

1. Для начального экрана можно использовать коммерчески доступные экраны, которые эксплуатируют разреженной матрицы неполной факториал методом проб условиях. Разреженной матрицы неполной факториал метод искаженных и выбраны из известных условий кристаллизации для макромолекул (Картер и Картер, 1979; Cudney и др., 1994;. Jancarik и Ким, 1991;. Jancarik и др., 1991). Если кристаллизация условие уже известно, узкий экран может быть собрана, варьируя осадителя концентрации и рН вокруг оригинального хита. Наиболее часто успешным осадителя полиэтиленгликоля (ПЭГ), затем следуют сульфат аммония. Вместе эти два осадителей приходится примерно 60% всех зарегистрированных макромолекулярных осадителей использован для кристаллизации (Гиллилэнд и др., 1994;. Кимбер и др., 2003;.. Страницу и др., 2003).
2. Подготовка решения кристаллизации. Как правило, эти условия сочетаются с осадителя, соль какого-то и буфер для установки рН. В некоторых случаях добавки могут быть добавлены специально для белок. Все акции решения должны быть отфильтрованы с помощью 0,22 мкм фильтр. Некоторые из маточного раствора может быть очень вязкой (50% ПЭГ, глицерин, ПЭГ-MME, и т.д.).
   • Подготовка 1,5 мл 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 М NaCl каждый в 0,1 М NaOAc рН 4,0, 4,3, 4,6 и 4,9 (в общей сложности 24 решений)
3. Оттепель вашего белка образца и держать на льду. Белки запасы должны храниться при температуре -80 ° С, если белок чувствителен к циклов замораживания / оттаивания (если да, то хранить при 4 ° С). Типичные концентрации белка в диапазоне 5-50 мг / мл, с более высокой концентрацией обычно дает лучшие результаты.
4. Спиновые образец 15min/18, 000xg / 4 ° C - некоторые белки, как правило, частично совокупности и осадок после оттепели шаг. Эти агрегаты могут способствовать аморфное осаждение остальных белковых молекул, поэтому тщательный спином вниз обеспечит вас есть только растворимые молекулы в вашей выборке. Держите белка на льду до создания лоток.
5. Определение концентрации белка от его поглощению при 280 нм с использованием УФ-спектрофотометр. Концентрация белка может быть вычислена по измерять оптическую плотность и коэффициент экстинкции белка. Коэффициент экстинкции может быть рассчитана с помощью инструмента ProtParam на Expasy сайте: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
6. Заполните скважин 24-а висит / сидя падение поднос с 500 мкл осадителя решение по схеме лоток установки (рис. 2В). Создать кольцо силиконовой смазки вокруг края хорошо. Кольцо должно иметь небольшой зазор, чтобы предотвратить наращивание давления воздуха, как хорошо запечатан. В сидя капли, нет необходимости для смазки с хорошо запечатана с лентой (рис. 2А).
7. Возьмите крышку слайд и очистите его со сгущенным воздухом спрей, или профессионального стереть - попадания в него пыли облегчит интерпретацию кристаллизации снижение и устранение загрязнения. Для сидя капель, крышка слайд не используются. Вместо этого, также содержит полка, на которой белка и осадителя носят смешанный характер.
8. Положите равные объемы образца белка и водохранилища решение на обложке слайда. Различные объемы белка и осадителя может быть осужден как часть процесса оптимизации. Использование большего количества белка, чем осадителя приводит к чистой концентрации белка в падение после равновесия, которое может быть желательным для разбавленных образцов белков, и, чтобы замедлить зарождения кристалла или рост. Любые другие нелетучих веществ в капле решение также будет сосредоточено столько же раз. Когда пипетирования белка и резервуар решения на крышку слайд, будьте очень осторожны, чтобы избежать образования пузырьков. Это часто происходит, когда воздух выдувается из пипетки.
   • Висячей капли: Load 2 мкл 50 мг / мл лизоцима в 0,02 М NaOAc рН 4,9 до центре крышки слайд и добавить к нему 2 мкл водохранилище решение.
   • Сидя капли: Load 2 мкл 50 мг / мл лизоцима решение центре шельфа и добавить к нему 2 мкл водохранилище решение.
9. Переверните крышку слайд мягко и отдать ее на смазку кольцо на верхней части колодца. Пресс мягко так, чтобы воздух мог выйти из скважины через выемку в смазку пр.событие давления воздуха наращивание хорошо и держать плотно закрытой. Давление воздуха в наращивание также может поднять крышку слайд, ущерба и печатью. В заседании капельным методом, оптически прозрачный лента используется для покрытия скважин. Следовательно, в этом методе уплотнения будут проводиться раз в строку / столбец.
10. Переходите к следующему хорошо, пока лоток завершена.
11. Проверьте лоток на установку - устранение частиц пыли и других загрязнений может уменьшить ложное срабатывание идентификации белковых кристаллов.
12. Используйте забил лист документировать эксперимент.
13. Место лоток на нужной температуры инкубации, как правило, от 4 до температуры ° С и комнаты. 20 ° С чаще всего успешно. Позаботьтесь, чтобы обрабатывать лоток мягко и избежать тряски. Будьте осторожны при открытии и закрытии двери инкубатора. Вибрации или изменения температуры во время передачи или инкубации может предотвратить рост кристаллов или отрицательно влияют на качество кристалла. Амортизирующие материалы (например, пенопласт упаковка) может быть использована в качестве набивки под кристалл лотков.
14. Проверьте лоток для кристаллов на следующий день, а затем каждые несколько дней, всегда обработки лотков с осторожностью. Документ каких-либо выводов и падение морфологии в лоток конкретный лист скоринга. Кристаллы обычно занимает 2-5 дней появляются, хотя кристаллы иногда появляются гораздо раньше (почти сразу) или выше (до нескольких месяцев!). Как только условия кристаллизации были выявлены и темпы роста кристаллов, как известно, лучше всего оставить лотки спокойно, пока кристаллы появились и выросли, по крайней мере половину своих окончательных размеров. Оставив лотки спокойно можете уменьшить количество кристаллических зародышей событий, что ведет к меньшим числом более крупных кристаллов.

2. Microbatch процедуры:

1. Образце белка и осадителя препарата, как описано выше.
2. Пневматическое распыление новый лоток microbatch, чтобы избежать пыли и других крупных частиц.
3. В microbatch лоток, заполните парафинового масла до 3 мм (как раз достаточно, чтобы покрыть скважин). Удалить доступ на нефть.
4. Нагрузка 1 мкл раствора белка (50 мг / мл лизоцима) в масло предварительно заполненных хорошо - убедитесь, что пипетка раствор непосредственно на дне колодца (рис. 2А).
5. Нагрузка 1 мкл раствора в осадок и в соответствии со схемой установки лотка (рис. 2Б) - убедитесь, что капля опускается на дно колодца и сливается с белком капли.
6. Перейти к следующему хорошо, пока лоток завершена.
7. Выполните шаги 11-14 из повешение / сидя падение процедуры.

3. Представитель Результаты:

Кристаллизация обычно называют узкое рентгеновской кристаллографии. Разреженной матрицы неполной факториал экране осаждения условиях обычно производит много различных типов агрегации белков и осадки, в том числе крупных монокристаллов. Если белка или осадителя концентрация слишком высока можно увидеть коричневые дело без каких-либо различных формы и размера (аморфные осадки). Когда решение недосыщены, падение часто будет вполне ясно и лишенной каких-либо осадков. На рисунке 3 показано несколько примеров для осаждения явлений и кристаллов (Дессау и соавт., 2006). Больше осадков явлений с более подробной интерпретации можно найти на http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .

Рисунок 1. Принцип кристаллизации белков.
Принцип кристаллизации белков. В эксперименте диффузии пара () равные объемы осадителя и белка присутствуют в капле. Вода будет диффузная, и как осадителя и концентрации белка будет удвоен до равновесие достигается между каплей и водохранилища решение. В пакетном кристаллизации (B) осадителя и концентрация белка не изменяются в процессе эксперимента. Точка - белка остается недосыщены кристаллов не может быть сформирована, Point B - белка происходит зарождение, кристаллы начали формироваться и концентрация белка в растворе падает до насыщения. Точка C - Белки осадков, но кристаллы могут по-прежнему расти. (C) Диализ кристаллизации использованием гель-подключен капилляр. Кристаллы появляются как соль диффундирует из белка выборки (и / или осадителя диффундирует в образце белка) через гель пробки.

Рисунок 2. План типичных экспериментов кристаллизации белков.
() Процедуры для подвешивания диффузии падение пары, сидя диффузии падение пара и кристаллизации microbatch белка. В каждом случае небольшого объема концентрированного образца белка смешивают с равным или меньшим объемом precipitanт решение и позволил, чтобы уравновесить. (B) Для кристаллизации куриного лизоцима, 24-а лоток устанавливается с различным содержанием хлорида натрия (осадок) и с 0,1 М ацетата натрия в качестве буфера при различных значениях рН (4,0 - 4,9).

Рисунок 3. Типичные результаты эксперимента кристаллизации белков.
(А) аморфные осадки. Когда белок или осадителя (или оба) находятся в высокой концентрации. (B) Разделение фаз. Белки или моющего средства могут быть разделены на различные фазы, когда смешивается с определенным осадителей при высокой концентрации. (C) Род формы кристаллов белка AtCSN7 полученные в полиэтиленгликоля 8000 и магния ацетат (Дессау и соавт., 2006). (D) Лизоцим кристаллы, полученные в 1,0 М NaCl и ацетата натрия рН 4,9. (Е) В насыщенном капель обычно остаются ясно. Фотограф Моше Дессау.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы расскажем и продемонстрировать общие текущие протоколы для кристаллизации белков. Так как это многоступенчатая процедура Есть несколько соображений, нужно быть в курсе. При работе с очень малых объемах (0,5-2 мкл), сушки капли за счет испарения является основной проблемо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysozyme		Sigma-aldrich	L6876-1G
24 well VDX Plate		Hampton research	HR3-142
24 well Cryschem Plate		Hampton research	HR3-158
Dow Corning Vacuum Grease		Hampton research	HR3-510
Siliconized glass circle coverslides		Hampton research	HR3-231
100% paraffin oil		Hampton research	HR3-411
1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape		Hampton research	HR3-511
96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)		Hampton research	HR3-098