X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

요약

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

초록

그들이 작동하는 방법 추론하기 위해 생물 학적 macromolecules의 3 차원 구조를 사용하는 것은 현대 생물학의 가장 중요한 분야 중 하나입니다. 원자 해상도 구조의 가용성 단백질 기능의 깊이와 독특한 이해를 제공하고, 살아있는 세포의 내부 동작을 해명하는 데 도움이됩니다. 날짜하려면, 단백질 데이터 은행 (rcsb - PDB) 항목의 86 %가 X - 레이 crystallography를 사용하여 결정 macromolecular 구조입니다.

crystallographic 연구에 적합한 결정을 얻으려면,이 macromolecule (예 : 단백질, 핵산, 단백질 - 단백질 복합 단백질이나 핵산 복합) 균질성을 정화해야하며, 가까이 가능한 균등 수 있습니다. 준비의 균질성는 (; 맥퍼슨 1999 Bergfors, 1999) 높은 해상도로 분해하다 결정을 얻기에있는 중요한 요인이다.

결정은 과포화에 macromolecule을 가져 필요합니다. 샘플 따라서 집합 또는 macromolecule (보통 20-50 MG / ML)의 강수량을 유발하지 않고 가능한 가장 높은 농도로 집중해야합니다. precipitating 대리인에게 샘플을 소개하는 솔루션에서 성장하는 대형 입체적인 결정이 발생할 수 있습니다 솔루션에 단백질 결정의 핵을 홍보할 수 있습니다. 수증기 확산 및 배치 결정 : 결정을 얻는 두 가지 주요 기술이 있습니다. 수증기 확산, 침전제 및 단백질 솔루션의 혼합물을 포함하는 드롭 순수한 침전제있는 챔버에 봉인합니다. 드롭과 침전제의 osmolarity가 (그림 1A) 동일 때까지 수증기 그 다음 드롭 아웃 diffuses. 평형이 달성 때까지 드롭의 탈수는 이상적인 위상 다이어그램의 결정 핵의 영역에, 단백질과 침전제 모두 느린 농도가 발생합니다. 배치 방법은 침전제의 해당 금액을 (그림 1B)와 혼합 단백질에 의해 직접 핵 영역에 단백질을 가져에 의존합니다. 이 방법은 일반적으로 드롭 밖으로 물의 확산을 방지하기 위해 파라핀 / 미네랄 오일 혼합에 따라 수행됩니다.

우리가 기름을 아래에 배치 결정 이외에 드롭하고 앉아 드롭 매달려, 증기 확산을위한 실험 설정의 두 종류를 보여줄 것입니다.

프로토콜

자료 :

• 단백질 샘플 - 라이 소 자임 (50 MG / ML)
• 드롭 24 잘 트레이를 달아
• 드롭 24 잘 트레이 앉아
• Microbatch의 결정 96 잘 트레이
• 결정화 솔루션 (중 사용 가능한 상업적 또는 집에​​서 만든)
• 실리콘 그리스
• Luer - 잠금없이 5 ML 주사기
• Siliconized 커버 슬라이드
• 광학 씰링 테이프
• 파라핀
• 낮은 유지 팁을 0.1-2 μL micropipette
• 족집게
• 프로 페셔널 쳐줍니다

1. 한깅 / 드롭 절차를 돌보기 :

1. 초기 화면 하나는 시험 조건의 스파스 행렬 불완전한 요소 방법을 이용 상용 화면을 사용할 수 있습니다. 스파스 매트릭스 불완전 요소 방법으로 편견과 macromolecules 알려져 결정화 조건 (카터와 카터, 1979; Cudney 외, 1994;. Jancarik과 김, 1991;. Jancarik 외, 1991)에서 선택됩니다. 결정화 조건이 이미 알려져있는 경우, 좁은 화면이 원래 공격 주변 침전제 농도와 산도 변화, 조립하실 수 있습니다. 가장 일반적으로 성공적인 침전제는 암모늄 황산 다음 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)입니다. 함께 결정 (길리 랜드 외, 1994.; 킴버 외, 2003;.. 페이지 외, 2003)에 사용되는 모든 기록 macromolecular의 precipitants의 약 60 %를 두 precipitants 계정.
2. 당신의 결정 솔루션을 준비합니다. 보통 이러한 조건은 precipitating 대리인, 일종의 소금과 산도를 설정하는 버퍼에서 결합됩니다. 어떤 경우에는 첨가제가 관심의 단백질을 위해 특별히 추가할 수 있습니다. 모든 주식 솔루션은 0.22 μm의 필터를 사용하여 필터링해야합니다. 주식 솔루션의 일부 (50 % 펙스, 글리세롤, PEG - MME 등) 매우 점성 수 있습니다.
   • 0.6 1.5 ML, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 0.1 M NaOAc 산도 4.0, 4.3, 4.6 및 4.9에서 1.6 M NaCl을 각각 (24 솔루션 총) 준비
3. 귀하의 단백질 샘플을 녹여 얼음 계속. 관심의 단백질 (그렇다면, 4 저장 ° C) / 해동 사이클을 멈추고 민감한되지 않는 단백질 주식은 -80 ° C에서 저장해야합니다. 일반적인 단백질 농도가 높은 농도는 일반적으로 더 나은 결과를 제공과 함께, 50-50 MG / ML의 범위에 있습니다.
4. 어떤 단백질은 해동 단계 이후 부분적으로 집계하고 침전하는 경향 - 15min/18이 000xg / 4 ° C 샘플을 스핀. 이러한 집합체 따라서 철저한 스핀은 아래로 당신의 예제에서만 용해 분자를 보증합니다 단백질 분자의 나머지 비정질 강수​​를 홍보할 수 있습니다. 트레이를 설정까지 얼음에 단백질 보관하십시오.
5. UV 분광 광도계를 사용하여 280 nm의 흡광도에서 자사의 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 농도는 흡광도 읽고 단백질의 흡광 계수로부터 계산하실 수 있습니다. : 흡광 계수는 Expasy 웹사이트에 ProtParam 도구를 사용하여 계산할 수 http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
6. 24 잘 매달려 / 트레이 설치 방식 (그림 2B)에 따라 침전제 솔루션을 500 μL와 드롭 트레이를 돌보기의 우물을 입력합니다. 우물의 가장자리 주위에 실리콘 그리스 반지를 만듭니다. 반지는 잘가 봉쇄로 공기 압력 상승을 방지하기 위해 작은 간격이 있어야합니다. 앉아 방울에서, 잘가 (그림 2A) 테이프로 밀봉되어 있기 때문에 그리스에 대한 필요가 없습니다.
7. 커버 슬라이드를 타고 압축된 공기 스프레이, 또는 닦아 전문으로 청소 - 피하 먼지가 결정화 드롭의 해석을 쉽게하고 contaminations을 제거합니다. 방울을 앉아 들어, 표지 슬라이드가 사용되지 않습니다. 대신, 잘은 단백질과 침전제가 혼합되는 선반이 포함되어 있습니다.
8. 표지 슬라이드에서 단백질 샘플 및 저수지 솔루션의 동일한 볼륨을 넣어. 단백질과 침전제 서로 다른 볼륨이 최적화 프로세스의 일부로 재판을받을 수 있습니다. 희석 단백질 샘플 바람직 수 있으며, 결정 핵이나 성장을 늦추기 위해 평균 후 드롭에 단백질의 그물 농도 침전제 결과보다 더 많은 단백질을 사용합니다. 드롭 솔루션의 다른 비휘발성 물질도 같은 요소를 기준으로 집중됩니다. 표지 슬라이드에 단백질과 저수지 솔루션을 pipetting 때, 거품 형성을 피하기 위해 매우주의하십시오. 이것은 종종 공기가 피펫의 터져 경우에 발생합니다.
   • 표지 슬라이드의 중심에 0.02 M NaOAc의 산도 4.9 50 MG / ML 라이 소 자임의 부하 2 μL하고 그것에 저수지 솔루션 2 μL를 추가 드롭 한깅.
   • 드롭 시팅 : 하중 선반의 중앙에 50 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 2 μL하고 그것에 저수지 솔루션 2 μL를 추가합니다.
9. 부드럽게 커버 슬라이드를 전환하고 잘 위에 기름 링에 누워. PR에 기름에 부드럽게 이렇게 공기가 노치를 통해 우물에서 탈출 수 눌러이벤트 공기 압력 우물에 상승과 유지는 잘 밀봉. 물론 공기 압력 상승은 잘 밀봉을 손상, 커버 슬라이드를 올릴 수 있습니다. 앉아서 드롭 방식에서 광학 맑은 투명 테이프는 우물을 커버하는 데 사용됩니다. 따라서이 방법 씰링의 모든 행 / 열 배치됩니다.
10. 트레이가 완료될 때까지 다음 잘로 이동합니다.
11. 설치시 트레이를 확인 - 먼지 입자와 기타 contaminations을 제거하는 단백질 결정의 거짓 긍정적인 인식을 줄일 수 있습니다.
12. 실험을 문서에 점수 시트를 사용합니다.
13. 일반적으로 4 ° C 룸 온도 사이에 원하는 부화 온도에 트레이를 놓습니다. 20 ° C는 가장 일반적으로 성공합니다. 부드럽게 트레이를 처리하고 떨고 않도록 조심해. 개방과 보육의 문을 닫는 동안주의하십시오. 양도하거나 배양 중에 진동이나 온도 변화가 크리스탈 성장을 예방하거나 부정적인 수정 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 재료 (예 : 포장 거품)을 흡수하는 충격은 크리스탈 쟁반에 따라 패딩으로 사용할 수 있습니다.
14. 결정에 대한 트레이 다음날을 확인 후 수일마다 항상주의 트레이를 취급. 트레이 특정 점수 시트에 결과와 드롭 morphologies를 문서. 크리스탈 가끔 훨씬 빨리 (즉시) 또는 그 이상 (최대 몇 개월까지!) 표시하지만 크리스탈은 일반적으로, 표시 2~5일 가져가라. 결정화 조건이 확인된과 결정의 성장 속도가 알려져 있습니다 일단 결정이 등장하고 그들의 최종 크기의 적어도 절반 성장 때까지, 그것은 쟁반은 그대로두고하는 것이 좋습니다. 트레이가 그대로두면 따라서 큰 결정의 작은 숫자를 생산, 크리스탈 핵 이벤트의 수를 줄일 수 있습니다.

2. 절차 Microbatch :

1. 단백질 샘플과 침전제 준비는 위에서 설명한 것처럼됩니다.
2. 에어 스프레이 새로운 microbatch 트레이는 먼지와 다른 큰 입자를 피할 수 있습니다.
3. microbatch 트레이에 높은 3mm (우물을 충당하기 위해 충분)에 파라핀 오일을 채우십시오. 오일의 액세스를 제거합니다.
4. 물론 미리 채워진 오일에 단백질 용액 (50 MG / ML 라이 소 자임) 1 μL를 로드할 - 잘 하단 (그림 2A)에 직접 솔루션을 피펫에 있는지 확인하십시오.
5. 드롭은 단백질 비말로 잘와 퓨즈의 바닥에 가라앉아 있는지 확인 - 잘 트레이 설치 방식 (그림 2B)에 따라로 침전제 솔루션 1 μL를로드합니다.
6. 트레이가 완료될 때까지 다음 잘 이동합니다.
7. 따라가 매달려 / 드롭 절차를 돌보기의 11-14 단계를 반복합니다.

3. 대표 결과 :

결정은 일반적으로 X - 레이 crystallography의 병목 현상이라고합니다. precipitating 조건의 스파스 행렬 불완전한 요소 화면은 일반적으로 큰 단일 결정 중에서 단백질 집합과 석출 다양한 종류를 생산하고 있습니다. 단백질이나 침전제 농도가 너무 높은 경우 하나는 불분명하다 모양과 크기 (비정질 강수​​량)와 갈색 문제를 볼 수 있습니다. 솔루션 undersaturated 때, 드롭은 종종 침전의 모든 종류의 완전히 명확하고 찾아볼 것입니다. 그림 3은 석출 현상과 결정 (데싸우 외., 2006)에 대한 몇 가지 예제를 보여줍니다. 자세한 해석과 함께 더 많은 강수량 현상은에서 찾을 수 있습니다 http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .

그림 1. 단백질 결정의 원칙.
단백질 결정의 원칙. 증기 확산 실험 (A) 침전제과 단백질 같은 볼륨 드롭에 존재한다. 물 밖으로 확산되며 평형은 드롭과 저수지 솔루션 사이의 달성 때까지 침전제 및 단백질 농도가 모두 두 배로됩니다. 배치 결정에 (B) 침전제 및 단백질 농도는 실험 기간 동안 변경되지 않습니다. 포인트 - 단백질은 더 크리스탈은, 포인트 B를 형성 수 없습니다 undersaturated 유지 - 단백질 핵이 발생, 수정은 양식에 시작 및 솔루션에서 단백질의 농도는 포화에 방울. 포인트 C는 - 단백질 precipitates하지만 결정은 여전히​​ 성장 수 있습니다. 사용 (C) 투석 결정 모세관 젤은 - 연결. 소금이 젤 플러그에 걸쳐 (및 / 또는 침전제 diffuses 단백질 샘플에) 단백질 샘플 밖 diffuses로 수정이 나타납니다.

그림 2. 전형적인 단백질 결정화 실험의 개요.
드롭 증기 확산을 매달려 드롭 증기 확산을 앉아하고, microbatch 단백질 결정화에 대한 (A) 절차. 각각의 경우에, 집중 단백질 샘플의 작은 볼륨 precipitan의 같거나 작은 볼륨 혼합t 솔루션과 평형 수있었습니다. (B) 닭고기 라이 소 자임, 2​​4 잘 트레이의 결정에 대한 나트륨 염화물의 다양한 농도 (침전제)과 다양한 PHS에서 버퍼로 0.1 M의 아세트산 나트륨 (- 4.9 4.0)로 설정됩니다.

그림 3. 단백질 결정화 실험의 일반적인 결과.
(A) 아몰퍼스 강수량은. 단백질 또는 침전제 (또는 둘 모두) 고농도에 때. (B) 단계 분리. 고농도에서 특정 precipitants과 혼합하면 단백질이나 세제는 다른 단계로 분리 수 있습니다. (C) AtCSN7의로드 모양의 단백질 결정은 폴리에틸렌 글리콜 8000 년 및 마그네슘 아세테이트를 (데싸우 외., 2006) 획득. (D) 라이 소 자임의 결정 1.0 M NaCl과 아세트산 나트륨의 산도 4.9에서 얻어진. (E) 포화 방울에서 일반적으로 분명 남아 있습니다. 모세 데싸우의 사진.

결과

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

토론

이 문서에서 우리는 단백질 결정화에 대한 일반적인 현재의 프로토콜을 설명하고 보여줍니다. 그 다단계 절차부터 몇 가지 고려 사항에 대해 알고 있어야 한 필요가있다. 증발로 인해 드롭의 건조 아주 작은 볼륨 (0.5-2 μL)과 함께 작업할 때하는 것은 중요한 관심사입니다. 따라서 그것은 잘 통제된 환경에서 작동하는 (낮은 공기 흐름, 높은 습도와 꽉 온도 제어)와 야외에있는 드롭의 노출을 최소?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Item
Lysozyme		Sigma-aldrich	L6876-1G
24 well VDX Plate		Hampton research	HR3-142
24 well Cryschem Plate		Hampton research	HR3-158
Dow Corning Vacuum Grease		Hampton research	HR3-510
Siliconized glass circle coverslides		Hampton research	HR3-231
100% paraffin oil		Hampton research	HR3-411
1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape		Hampton research	HR3-511
96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)		Hampton research	HR3-098